維生素C可直接參与真核生物的DNA修飾

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DNA的化學修飾對基因表達具有重要的調控作用。目前已經發現的DNA修飾主要有5mC，6mA，5hmC，5fC，5caC，5hmU和base J（下圖）。5-甲基胞嘧啶 (5mC) 作為其中最重要的表觀遺傳修飾鹼基，廣泛存在於多種生物的基因組中。近年研究發現，TET雙加氧酶 (Ten-Eleven Translocation dioxygenases) 可以對胞嘧啶的5位甲基進行逐步氧化，依次生成5-羥甲基胞嘧啶 (5hmC), 5-醛基胞嘧啶 (5fC) 以及5-羧基胞嘧啶 (5caC)（下圖）。後兩者可以被TDG糖苷酶識別，通過鹼基切除修復 (Base Excision Repair) 途徑，完成DNA去甲基化過程【1-3】。

除了哺乳動物，其他很多生物中也存在TET雙加氧酶的同源蛋白，包括一些單細胞真核生物，比如萊茵衣藻。但我們對這些TET同源蛋白的認識還幾乎是一片空白。解析其他生物中TET的酶活性與功能，可以幫助我們理解TET在進化過程中的保守性，並有助於深入解析DNA的去甲基化究竟怎麼發生。

2019年5月2日，Nature期刊在線發表了由我國科研人員徐國良、唐惠儒與黃開耀共同指導、中科院與復旦大學等多個單位協作完成的題為A vitamin C-derived DNA modification catalysed by an algal TET homologue的研究成果。該工作發現，在研究光合作用和纖毛的真核單細胞模式生物 — 萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中，TET同源蛋白可以將維生素C的半個分子的碳基骨架轉移到DNA上，從而產生一種全新的DNA表觀修飾。

研究者們首先在衣藻中找到了8個TET同源蛋白。對其中的CrTET1進行酶活分析後，發現這一蛋白具有不同於哺乳動物TET的5mC催化活性，並將其命名為CMD1(5-methylcytosine modification enzyme 1)。進一步研究表明，CMD1可催化5mC產生兩種新的DNA修飾核苷，分別被命名為P1, P2。通過質譜與核磁共振實驗，研究者解析了他們各自的化學結構。P1和P2互為立體異構體，它們在5mC的甲基碳上衍生了一個甘油基, 因此研究者們將這個新的DNA修飾核苷命名為5-glyceryl-methylcytosine (5gmC)。這也是在自然界中發現的第12種DNA鹼基（第8種DNA修飾鹼基）。

在研究5gmC新增的甘油基的來源時，研究者驚喜地發現，傳統雙加氧酶反應中所必需的α-酮戊二酸 (2-oxoglutarate, 2-OG) 【4】存在與否對CMD1的酶活並無任何影響，這表明CMD1在反應機理上與TET有所不同。維生素C (Vitamin C, VC) 替代了2-OG參與CMD1的酶活反應。更令人驚訝的是，VC的C4-C6碳基骨架的部分被轉移到5mC上，在5mC基礎上形成了5gmC，這表明小分子代謝物對錶觀遺傳學的影響可能遠遠超出目前的理解範圍。在此基礎上研究者們進一步解析了CMD1酶活反應的機理，發現CO2與乙醛酸為VC的反應副產物。

研究者們還進一步闡述了CMD1酶以及5gmC修飾的生理功能。他們首先在衣藻中開發完善了高效的CRISPR/Cas9基因編輯方法，獲得了CMD1突變以及VTC2突變（VC合成過程的一個關鍵基因）藻株。在分別敲除兩種基因的藻株中，5gmC含量都明顯降低，而5mC含量則明顯增加。進一步觀察發現，cmd1突變藻株對強光的適應能力明顯降低，RNA-Seq結果發現衣藻中與適應強光有直接關係的LHCSR3基因顯著下調，同時發現LHCSR3.1基因的甲基化水平升高，這可能是導致其表達下調的一個原因。這也提示在某些特定區域內，CMD1可能參與了DNA去甲基化。研究者認為，除了與光合作用的調控有關以外，CMD1產生的DNA新修飾5gmC可能還有未知的生理功能有待探索。

總的來說，這項工作揭示了衣藻中存在一種由TET同源蛋白CMD1產生的全新的核酸修飾，使DNA雙鏈形成四個碳原子相連的分叉，同時這種修飾介導光合作用的反饋調控。這項工作中CMD1催化的生化反應、維生素C的新功能以及甲基化DNA之上的進一步修飾都是令人驚喜的發現，它們極大地拓展了DNA結構與功能的內涵，加深了人們對生物適應環境機制的認識。

徐國良團隊在DNA氧化去甲基化領域探索十餘年，發現了動物TET酶催化產生5caC而參與DNA主動去甲基化（Science, 2011）; 揭示了TET酶在哺乳動物胚胎髮育中的作用（Nature, 2011; Nature, 2016）（詳見：徐國良院士在《Nature》發表文章闡明TET家族蛋白在胚胎髮育中的重要作用）。

據悉，除上述三個課題組以外，中科院生化與細胞研究所丁建平、陳洛南，中科院有機所劉文、朱正江，上海師範大學馬為民，中科院營養所尹慧勇，RWTH Aachen University的Elmar Weinhold，University of Pennsylvania的Rahul M. Kohli等實驗室也參與了最近發表的研究。徐國良課題組薛劍煌博士、陳國棟博士、陳輝，以及唐惠儒課題組豪富華博士為本文共同第一作者。

專家點評

何川（HHMI研究員、芝加哥大學化學系終身教授 、John T. Wilson Distinguished Service講席教授）

自然界的RNA上有150種以上的化學修飾。 而生物體的DNA上化學修飾種類要少很多。除去各種DNA損傷， 有調控功能的DNA修飾就更少了。 目前知道的不到十個（5mC，5hmC，5fC，5caC，6mA，5hmU，base J）。很多細菌的DNA有高丰度的6mA來調控各種機制。而很多真核生物的DNA有5mC來抑制基因表達。2009年美國的兩個課題組在科學雜誌（Science 2009a，2009b）上報道了一個paradigm-shifting的發現。他們在哺乳動物DNA上發現了有相對於DNA損傷更高丰度的5-hydroxymethylcytosine (5hmC)。Anjana Rao 實驗室進一步發現哺乳動物的TET酶催化了DNA上從5mC到5hmC的轉化。2011年徐國良實驗室和張毅實驗室發現TET可以催化DNA從5mC到5hmC，再到5-formylcytosine (5fC)和5-carboxylcytosine (5caC)的轉化 (Science 2011a，2011b）。徐國良實驗室發現DNA損傷修復酶TDG識別5caC， 通過DNA修復轉化5caC回到沒有修飾的C, 第一次揭示了一個DNA主動去甲基化的過程和機理。

TET在哺乳動物里的功能已經有了較多的研究。TET2和DNMT3A的突變都可以導致白血病。TET敲除導致全基因組的低甲基化而不是預期的過甲基化。TET不是哺乳動物專有的。 在低等真核生物里也存在。TET除了催化DNA上5mC的氧化也可以催化RNA上m5C的氧化。在綠藻的基因組裡有八個TET同系蛋白。徐國良和合作者通過生物化學實驗發現CrTET1（作者重新命名為CMD1）可以催化DNA上的5mC形成兩種全新的產物。通常含單鐵的雙加氧酶用αKG做為輻助分子，用活性中心的鐵激活氧氣產生高價的鐵氧化物來氧化甲基。 氧氣活化需要四個電子。αKG的主要功能是提供兩個電子。另兩個由鐵離子提供。作者發現CrTET1不用αKG做為輔助分子而用維生素C。維C不但提供氧氣活化的兩個電子還參於了5mC的氧化修飾。維C的一段甘油部分在氧化後接到了氧化產物上產生了兩個新的5mC衍生物5gmC。當CMD1被敲除之後，在正常生長條件下對衣藻的生長並沒有明顯影響。但是在強光環境下，由於5gmC修飾的降低，可能導致5mC去甲基化過程受阻，可以上調一些基因的表達以對綠藻有保護作用。

這個工作有幾個亮點。首先作者找到了兩個互為stereoisomer（立體異構體）的新的DNA修飾， 並證實這兩個修飾可以調空基因表達。作者找到了TET在單細胞真核生物里的DNA甲基化修飾功能。揭示了TET的DNA甲基修飾可能是進化里相對保守的功能。我個人覺的很有意義的發現是維C可以替代αKG做為輻助分子激活氧氣。 這是生物化學上很有意義的發現。含單鐵用αKG激活氧氣的酶是一個很大的家族。去甲基酶只是其中一部分。很有可能其他含單鐵的氧化酶也有一部分可能用維C做為輻助分子提供氧氣活化所需的電子， 而維C並不一定需要成為產物的一部分。這個可能性以前在生物化學上被忽視了。科研水平和層次有高下之分。區別在哪呢？做科研的第一目標是 discover new knowledge，這篇文章做到了。

原文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41586-019-1160-0

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