Plos Biology：基於甲型肝炎病毒抗原表位結構的靶向藥物篩選

近日，中國科學院生物物理研究所研究員王祥喜、中科院院士饒子和和四川大學教授蘇丹合作，在國際期刊Plos Biology雜誌上在線發表了題為Structural basis for neutralization of hepatitis A virus informs a rational design of highly potent inhibitors的論文，研究解析了甲型肝炎病毒與多株中和性抗體複合物三維結構，發現了甲型肝炎病毒獨特的保守抗原表位並利用該表位的結構進行靶向篩選藥物化合物庫和活性驗證，最後發現一種用於頭頸部癌症治療藥物可以作為治療甲型肝炎病毒感染藥物開發的先導化合物。由結構到靶向藥物篩選的策略對於發現針對其他人類重大疾病相關病毒的藥物開發具有重要的借鑒意義。

甲型病毒性肝炎（Type A viral hepatitis），是由甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus, HAV）引起的一種傳染病，感染HAV後可引起不同程度的急性癥狀。現今全球每年仍有150萬甲型肝炎病毒的感染病例。甲型肝炎作為一種傳染病，其流行、爆發與該地區的收入狀況、衛生和生活條件密切相關。目前，甲型肝炎持續威脅著衛生和生活條件差的一些地區。然而最近大量研究發現，發達國家由於許多成年人缺乏天然或疫苗誘導的獲得性甲型肝炎免疫，導致甲型肝炎在這些地區大量爆發，開始成為一種新的公共衛生問題。

儘管HAV疫苗是預防甲型肝炎的最有效的方式，但目前全世界範圍內僅有16個國家和地區將甲肝疫苗納入常規免疫接種範圍，所以全世界範圍內甲型肝炎感染的負擔仍然很重。對於甲型肝炎的治療，尤其是針對大規模的突發性感染，到目前為止還未有特異性治療藥物上市，所以對於相關藥物研製尤為迫切。

1、4株高中和活性HAV小鼠單克隆抗體的篩選

中和性抗體與病毒複合物精細三維結構的研究是確定其精確結合位點最直接、高效的技術手段，對於揭示機體免疫抑制機制及抗病毒藥物的研發起到至關重要的作用。基於此，相關研究人員篩選得到4株新的高中和活性的抗體F4、F6、F7和F9，其對HAV的50%中和活性可達0.1~0.85nM範圍。進一步的研究發現，這4株中和性抗體和之前分離得到的R10中和性抗體一樣能高效地抑制病毒與宿主細胞的結合（圖1）。

Fig 1. Characterization of F4, F6, F7, F9, and R10 mAbs.

2、HAV與單抗複合物的電鏡結構H及特殊相互作用

研究人員採用低溫冷凍電鏡單顆粒重構技術解析了4株中和性抗體與HAV複合物的高解析度三維結構。通過對複合物結構比較，發現這幾株中和性抗體均圍繞在五次軸周圍，結合在衣殼蛋白五聚體邊緣，位於二次軸和三次軸之間，橫跨兩個五聚體，識別HAV衣殼蛋白上由VP3和VP2的共同組成的空間構象型表位（圖2，圖3）。

Fig 2. HAV與4株單抗的複合物結構

Fig 3. Typical interaction between HAV with F6 Fab.

3、HAV單一獨特表位的發現與藥物篩選

結合F4，F6，F7和F9結合的HAV的高解析度低溫電子顯微鏡（cryo-EM）結構以及之前對抗原結合-HAV複合物的R10片段的研究結果，研究進一步揭示了由5種中和單克隆抗體識別的表位的位置和性質。研究發現，這些單抗識別結合的抗原表位在人源的6種HAV基因型中都極其保守（圖4），抗原表位的大部分氨基酸分布在一個「溝壑」兩旁，該區域在前期研究中被證實正是受體結合的潛在位點，這些特性都表明該區域是個理想的小分子抑製劑結合靶點（圖5）。

針對這個靶點，研究人員在單克隆抗體的重鏈中選擇了對衣殼蛋白結合有重要貢獻的四個氨基酸殘基作為藥效團進行建模，並利用這一藥效團模型在DrugBank庫中進行了大規模的計算機模擬藥物篩選。通過體外抑制實驗，從DrugBank庫中篩選到一個抑制效果最佳的先導藥物——golvatinib (IC50約為1uM)（圖6）。功能實驗證明，golvatinib分子並不引起HAV顆粒穩定性改變，而是通過阻斷HAV與細胞表面受體的結合進而起到抑制HAV感染的作用，研究者最後根據分子對接的結構從原子水平分析了其抑制機理，為進一步改造這一先導化合物提供了理論依據。

Fig 4. Analysis of the conservation and structure activity correlates of F4, F6, F7, F9, and R10 Fab.

Fig 5. The single, conserved antigenic site on the surface of HAV.

Fig 6. In silico–designed anti-HAV drug candidates.

Plos Biology雜誌特邀紐西蘭奧塔哥大學電子顯微鏡中心主任MihneaBostina就本文針對該研究領域撰寫綜述。同時也在網站首頁進行了新聞宣傳報道。這是饒子和/王祥喜聯合研究團隊繼解析甲型肝炎病毒精細三維結構(Wang X, et.al Nature 2015）、揭示甲型肝炎病毒中和性抗體R10「受體模擬」的中和機制(Wang X, et.al PNAS 2017）後又一重要研究成果，也是由結構到靶向藥物篩選的研究典範。研究人員基於全病毒顆粒抗原表位結構進行藥物設計與篩選的這一策略，對於發現針對其他人類重大疾病相關病毒的藥物開發是十分值得借鑒的。

本研究得到中科院先導專項、中科院重點部署項目、科技部「973」項目、國家自然科學基金等資助。曹磊、劉岯和楊盼為該文的共同第一作者，王祥喜、饒子和和蘇丹同為該文的通訊作者。

ABSTRACT

Hepatitis A virus (HAV), an enigmatic and ancient pathogen, is a major causative agent of acute viral hepatitis worldwide. Although there are effective vaccines, antivirals against HAV infection arestill required, especially during fulminant hepatitis outbreaks. A morein-depth understanding of the antigenic characteristics of HAV and the mechanisms of neutralization could aid in the development of rationally designed antiviral drugs targeting HAV. In this paper, 4 new antibodies—F4, F6,F7, and F9—are reported that potently neutralize HAV at 50% neutralizing concentration values (neut50) ranging from 0.1 nM to 0.85 nM. High-resolution cryo-electron microscopy (cryo-EM) structures of HAV bound to F4, F6, F7, andF9, together with results of our previous studies on R10 fragment of antigen binding (Fab)-HAV complex, shed light on the locations and nature of the epitopes recognized by the 5 neutralizing monoclonal antibodies (NAbs). All the epitopes locate within the same patch and are highly conserved. The key structure-activity correlates based on the antigenic sites have been established. Based on the structural data of the single conserved antigenic site and key structure-activity correlates, one promising drug candidate named golvatinib was identified by in silico docking studies. Cell-based antiviral assays confirmed that golvatinib is capable of blocking HAV infection effectively with a 50% inhibitory concentration (IC50) of approximately 1 μM. These results suggest that the single conserved antigenic site from complete HAV capsid is a good antiviral target and that golvatinib could function as alead compound for anti-HAV drug development.

1.Lei Cao ,Pi Liu ,Pan Yang ,Qiang Gao,Hong Li,YaoSun,Ling Zhu,Jianping Lin,Dan Su ,Zihe Rao, Xiangxi Wang.Structural basis forneutralization of hepatitis A virus informs a rational design of highly potent inhibitors.PLoS Biol. 2019 Apr30;17(4):e3000229.

doi: 10.1371/journal.pbio.3000229. eCollection 2019Apr.

2.中科院生物物理研究所:生物物理所等發現治療甲型肝炎先導化合物

http://www.cas.cn/syky/201905/t20190505_4690787.shtml

本期編輯：Annabella

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