首次實現活細胞單基因轉錄可視化

轉錄是以DNA為模板合成RNA的過程，作為中心法則中的重要環節，其調控一直是生物學研究中的熱點。真核生物的轉錄調控涉及到的蛋白眾多，包括RNA聚合酶II、轉錄因子（Transcription factor）、中介因子複合體（Mediator）、chromatin reader/remodeler等。由於涉及的蛋白多、細胞核內結構複雜，所以如何研究細胞內的轉錄調控機制，一直是一項巨大的挑戰。利用超分辨顯微鏡在活細胞體內直接對單個基因的轉錄事件進行觀察分析，一直是研究人員的夢想。在此之前，相關研究主要集中在細胞內構建高拷貝基因晶元觀測Pol II的動態，或者利用超分辨顯微鏡PALM（Live cell photo activation）提高活體解析度。這兩種方法都有較為明顯的局限性：前者的問題是基因晶元是人為合成的具有重複區段的轉錄系統，雖然可以增強信號，但它無法真正代表內源基因；後者則由於無法標記大部分熒光分子因而很難實時監測單個基因的轉錄事件。

2019年5月30日，美國紐約紀念斯隆-凱特琳癌症中心結構生物學系Alexandros Pertsinidis課題組在Cell上發表了題為Single-Molecule Nanoscopy Elucidates RNA Polymerase II Transcription at Single Genes in Live Cells的研究論文，研發了一項結合3D STED（stimulated emission depletion）和target-locking的新型高靈敏單分子熒光成像技術，在活細胞體內首次監測了精確到單個基因位點上的轉錄事件，並實現了對RNA聚合酶II （Pol II）、轉錄調控因子（Regulatory Factors， RF）以及內源轉錄本的實時定量分析，揭示了真核細胞轉錄調控網中各種組分的分子調控機理，為深入了解轉錄調控提供了重要工具。

為了克服上述方法的局限，Pertsinidis課題組研發了一類全新的超分辨成像技術：通過構建3D STED超高解析度顯微鏡，再結合target-locking技術，研究人員首次在活細胞內觀測到了單一內源基因上的轉錄事件。

研究人員在小鼠幹細胞中利用特異的RNA 探針分別標記了兩個單一拷貝的內源基因（Pou5f1和Nanog）的轉錄本，他們實時監測、追蹤並且對這兩個特異基因位點上的Pol II和調控因子RF（Sox2, Brd4, Cdk9, Med22）進行了絕對定量。結果顯示，在Pou5f1位點上，Pol II信號和調控因子 RF 信號並非精確共定位。相比Pol II，調控因子距離 3" UTR RNA探針更遠，這表明這四種調控因子主要分布在距離轉錄本較遠的增強子區域。相關藥物處理以及定點FRAP（Fluorescence Recovery After Photobleaching）實驗證明，Pou5f1上的Pol II主要參與了轉錄延伸（transcription elongation）和終止（transcription termination）過程，Pol II參與轉錄後立即被釋放，並沒有被回收利用（recycling）。

此外，實驗結果顯示通過施加不同濃度的Brd4抑製劑 JQ1，可以調控增強子區域Brd4 信號強弱進而影響Pou5f1轉錄本活性高低。這一結果證明了增強子區域的調控因子直接參与了靶基因的轉錄調控。有趣的是，研究人員還發現不同基因對於JQ1的響應也不盡相同：Nanog基因增強子區的Brd4信號強弱控制了該基因的轉錄頻率（bursting frequency）。

該研究表明，活細胞內的轉錄調控可能比人們目前所知的更為複雜、更加精細。而此文中報道的新型超高解析度顯微鏡，為人們進一步研究相關分子機制提供了強有力的工具。

原文鏈接：

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)30557-4

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