調控中腦多巴胺神經元的基因表達

王小果

儘管中腦神經元數量只佔不到1%的大腦神經元，但是它卻是多巴胺神經元的主要來源【1】。多巴胺（dopamine，DA）是兒茶酚胺類神經遞質，可以與腦內廣泛表達的多巴胺能受體結合，在中樞神經系統中有著極其重要的作用，多巴胺神經元可調節和控制許多重要的行為過程，其中包括運動、認知、獎賞、情感、學習記憶和神經內分泌的調節等。一直以來認為中腦多巴胺主要由3個DA神經元核群合成：腹側被蓋區（VTA）、黑質緻密區（SNc）、紅核後區。目前對於多巴胺信號在生理狀態和疾病狀態下的作用研究甚多，但是對於染色質結構是如何讓調控中腦多巴胺神經元上的基因表達知之甚少。

近日，美國波士頓兒童醫院遺傳與兒科系講席教授、哈佛大學醫學院遺傳學系Fred Rosen 講席教授、表觀遺傳學領域最出色的科學家之一、霍華德休斯醫學研究所研究員張毅教授課題組在Nature Communications上發表了In vivo nuclear capture and molecular profiling identifies Gmeb1 as a transcriptional regulator essential for dopamine neuron function【2】的文章，開發了一個用於特異性分離高純度中腦腹側被蓋區多巴胺神經元細胞核的新方法，收集少量特異性的細胞核進行染色質可接近性(chromatin accessibility），最終鑒定了具體功能未知的關鍵調控因子Gmeb1可以調控中腦多巴胺神經元的基因表達，並能夠維持小鼠的多種運動功能。從方法學和功能研究上都具有十分重要的意義！

為特異性標記中腦神經元，研究人員構建了病毒AAV-DIO-KASH-HA，注射到多巴胺轉運體-cre小鼠（dat-cre），以此實現KASH-HA特異性表達在中腦神經元上。免疫熒光實驗發現酪氨酸羥化酶（TH，一種兒茶酚胺合成的限速酶，可作為中腦神經元的標記物）和HA共標達到87.2%，此外，多巴胺和HA共標達到97.3%，這些結果表明KASH-HA特異性表達在中腦神經元上（圖1）。

圖1 KASH-HA標記用於轉錄組學分析

利用熒光激活細胞核分選技術將HA陽性細胞和HA陰性細胞區分開以後，再結合RNA測序技術發現HA陽性細胞和HA陰性細胞共存在13727個基因表達，其中在HA陽性細胞上存在394個基因富集表達（表達量至少是HA陰性細胞的4倍以上）。儘管這些基因富集表達在中腦多巴胺神經元上，但是它們也會在其他神經元類型上表達。研究人員進一步和其他三種類型的神經元（表達血管活性腸肽的神經元、興奮性皮層神經元、表達小清蛋白的神經元）進行比較後發現107個基因在中腦多巴胺神經元上富集，將其命名為中腦多巴胺富集基因（mDA-enriched genes）。

接下來，研究人員進一步想知道激活這些富集基因的轉錄調控因子，他們構建了中腦神經元的DNaseI超敏感位點（調節性DNA序列的標記物）圖譜，發現了28084個DNaseI超敏感位點，超過40%的位點位於基因啟動子序列內，其中2374個位點富集在中腦多巴胺神經元上（染色質開放區域只在中腦神經元上）。很意外的是，這些富集在中腦神經元上DNaseI超敏感位點並不在啟動子序列內。進一步發現存在11個轉錄因子參與調控中腦富集基因，其中糖皮質激素調節因子結合蛋白-1（Gmeb1，glucocorticoid modulatory element binding protein-1）最具潛力的候選因子，它可以調控多巴胺合成、多巴胺囊泡組裝、多巴胺再攝取、自調節等過程（圖2）。

圖2調控中腦富集基因的轉錄因子

以往研究發現Gmeb1可以促進對低糖皮質激素的敏感性，也可以在氧化應激過程中起到神經元保護作用【3】。如果敲除中腦Gmeb1會產生什麼功能影響？研究人員向中腦注射Gmeb1沉默病毒後發現該腦區存在79個表達上調的基因，99個表達下調的基因（包括9個中腦富集基因），不會造成該腦區神經元死亡，但是會降低多巴胺和酪氨酸羥化酶的表達（圖3）。

圖3 敲低中腦Gmeb1後引起酪氨酸羥化酶Th的表達發生變化

由於酪氨酸羥化酶減少後多巴胺合成降低，多巴胺信號的紊亂會進一步影響運動功能。因此，研究人員向黑質緻密部注射Gmeb1沉默病毒後利用細胞吸附式電記錄實驗發現敲低Gmeb1不會影響該腦區神經元的興奮性、放電頻率，但是會影響其運動功能，具體表現為在旋轉實驗中（評價小鼠耐受疲勞，平衡控制、運動協調能力）小鼠呆在輪轉棒上的時間減少，說明運動協調能力降低；游泳實驗中小鼠的游泳運動能力降低。

總的來說，本文開發出一種基於病毒的標記中腦多巴胺神經元的細胞核捕獲技術，利用該技術首次發現轉錄因子Gmeb1調控中腦多巴胺神經元的基因表達，並參與很重要的運動功能，因為從分子水平及表型兩方面來看，抑制Gmeb1 表達跟Parkinson Disease 很相似，這一工作為研究PD提供了很好的小鼠模型。由於開發的這項新技術能夠解決神經生物學領域細胞特異性分離的問題，因此今後對於神經退行性疾病相關的特異性轉錄調控研究具有重要的意義。

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