基因編輯最新研究進展一覽

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谷 君 說

本期為大家帶來的是基因編輯領域的最新研究進展，希望讀者朋友們能夠喜歡。

基因編輯最新研究進展一覽

文/dingka

Science子刊：一種新型腺嘌呤鹼基編輯器可讓細胞RNA編輯最小化

DOI: 10.1126/sciadv.aax5717.

在一項新的研究中，來自美國布羅德研究所和哈佛大學的研究人員發現有證據表明使用鹼基編輯器會導致細胞中出現意想不到的RNA編輯。相關研究結果發表在2019年5月8日的Science Advances期刊上，論文標題為「Analysis and minimization of cellular RNA editing by DNA adenine base editors」。在這篇論文中，他們描述了他們對CRISPR類型腺嘌呤鹼基編輯器（ABE）的研究，以及他們取得的發現。

ABE將一個DNA鹼基對轉換成另一個DNA鹼基對，從而允許修復某些細胞類型中的突變，而不會產生不想要的編輯效應。據認為，ABE還有潛力校正幾乎一半已知的導致醫學疾病的遺傳異常。ABE的科學基礎對醫學界來說變得越來越重要。不幸的是，最近的一些研究已發現，ABE可能也會導致意料之外的編輯。在今年3月，一個研究團隊發現胞嘧啶鹼基編輯器3型（CBE3）以高於正常的速率誘導單核苷酸變異。在上個月，另一個研究團隊發現胞嘧啶鹼基編輯器（CBE）和ABE導致RNA中的脫靶編輯。在這項新的研究中，這些研究人員試圖在使用ABE時進一步測試脫靶編輯，並在確認後找到一種解決方案。

這些研究人員以一種包括人細胞系中所有細胞RNA轉錄本的方式分析了ABE的最新版本，稱為ABEmax，而且他們使用比其他人使用的更靈敏的工具來做到這一點。他們報道他們確實在RNA樣本中發現了低水平的脫靶編輯。為了解決這個問題，他們開發了在保留在靶鹼基編輯的能力同時導致較少RNA編輯的新型ABE變體（基於滅活的野生型大腸桿菌）。他們進一步報道說，這些新型變體是以一種讓RNA和DNA編輯過程解耦合的方式構建出來的，這樣就能夠最大限度地減少DNA和RNA中的脫靶編輯。

這些研究人員得出結論：由於較低的RNA編輯且較短的RNA半衰期，對未來研究的干擾程度可能取決於它們的具體應用。他們建議尋求讓RNA編輯最小化的科學家們使用他們構建出的一種新變體---他們稱之為ABEmaxQW。

Cell：首次發現阻斷CRISPR-Cas9基因組編輯的小分子抑製劑

doi:10.1016/j.cell.2019.04.009.

在一項新的研究中，來自美國布羅德研究所等研究機構的研究人員發現釀膿鏈球菌Cas9（SpCas9）的首批小分子抑製劑能夠更精確地控制基於CRISPR-Cas9的基因組編輯。具體而言，他們通過開發一系列高通量生物化學分析方法和基於細胞的分析方法，篩選了許多小分子，以便鑒定出能夠破壞SpCas9與DNA結合因而干擾它的DNA切割能力的化合物。這些首批小分子CRISPR-Cas9抑製劑很容易進入細胞，並且比之前發現的抗CRISPR蛋白小得多。這些新化合物可以對基於SpCas9的編輯技術進行可逆的和劑量依賴性的控制，包括它們在哺乳動物細胞中進行基因編輯、鹼基編輯和表觀遺傳編輯的應用。相關研究結果發表在2019年5月2日的Cell期刊上，論文標題為「A High-Throughput Platform to Identify Small-Molecule Inhibitors of CRISPR-Cas9」。

論文通訊作者、布羅德研究所的Amit Choudhary說道，「這些技術為快速鑒定和使用針對SpCas9和下一代CRISPR相關核酸酶的小分子抑製劑奠定了基礎。靶向CRISPR相關核酸酶的小分子抑製劑具有廣泛應用於基礎研究、生物醫學和國防研究以及生物技術應用的潛力。」

當前，SpCas9正在開發作為多種疾病（包括艾滋病、視力障礙、肌肉萎縮症和其他遺傳性疾病）的基因治療試劑。但是，這些治療應用將極大地受益於對SpCas9活性的劑量和時間安排進行精確控制以減少脫靶效應。控制SpCas9活性的這些方面也可能使其他應用受益，比如對模型生物的DNA進行高效編輯來構建疾病模型和研究疾病，以及在基因工程蚊子中使用基因驅動來遏制瘧疾和其他蚊子傳播疾病。

對SpCas9的劑量和時間控制的需求已產生了對抗CRISPR分子的需求。儘管存在靶向SpCas9的抗CRISPR蛋白，但是它們是大分子，不易滲透到細胞中，起著不可逆的作用，可被蛋白酶分解，並且可能在體內存在引起不良免疫反應的風險。相反，小分子抑製劑在蛋白水解上是穩定的，可逆的，通常是非免疫原性的，並且能夠通過被動擴散輕鬆地遞送到細胞中。此外，它們可以低成本地大規模合成，具有很小的批間差異。

在這項新的研究中，Choudhary及其團隊推出了一個強大，靈敏且可擴展的平台，用於快速、經濟地鑒定和驗證SpCas9的小分子抑製劑。鑒於SpCas9酶的特性，以高通量方式測量CRISPR-Cas9活性從而進行藥物篩選一直是具有挑戰性的。為此，Choudhary團隊分別開發了針對SpCas9-DNA結合和SpCas9 DNA切割活性的高通量初級和二級測定方法。對於初級測定，他們使用一種稱為熒光偏振的生物化學技術來監測SpCas9與含有PAM序列的經過熒光團標記的DNA片段之間的相互作用。在二級測定中，他們使用自動顯微鏡來測量在細胞中由SpCas9介導的對報告基因進行DNA切割後產生的熒光變化。

通過使用這些測定方法，這些研究人員首先篩選了多種類型小分子的代表成員，以確定其成員經常抑制SpCas9的小分子類型。他們鑒定出兩種先導化合物，它們以劑量依賴性方式破壞了哺乳動物細胞中SpCas9結合DNA和抑制SpCas9介導的DNA切割的能力。鑒於這些小分子阻斷這種酶結合DNA，因此它們還抑制SpCas9的催化活性受到破壞的編輯技術，包括用於轉錄激活的那些技術，而且在人血漿中是穩定的。

Choudhary說，「這些結果為對CRISPR-Cas9活性的精確化學控制奠定了基礎，從而能夠安全地使用這些技術。然而，這些分子還沒有為人類應用做好準備，也沒有在生物體內進行功效測試。」

在未來的研究中，這些研究人員計劃鑒定這些抑製劑在SpCas9:gRNA複合物上的結合位點，研究它們的作用機制，並優化它們的功效。他們還將確定這些分子是否與哺乳動物細胞中的其他靶標相互作用，並評估它們對其他的CRISPR相關核酸酶的特異性。這項新研究的早期結果表明這些分子對它們的靶標極具特異性，這是因為它們對與SpCas9的親緣關係較遠的CRISPR相關酶Cas12a沒有影響。

Science子刊：我國科學家開發出一種可遠程控制的基因編輯平台

DOI: 10.1126/sciadv.aav7199.

在一項新的研究中，來自中國南京大學、南京工業大學和廈門大學的研究人員開發出利用病毒將CRISPR-Cas9基因編輯工具運送到特定細胞中的一種替代方法，它涉及使用兩種類型的光。相關研究結果發表在2019年4月3日的Science Advances期刊上，論文標題為「Near-infrared upconversion–activated CRISPR-Cas9 system: A remote-controlled gene editing platform」。在這篇論文中，他們描述了他們的新型載體以及它在試驗用小鼠中的效果。論文通訊作者為南京大學的宋玉君（Yujun Song）教授、南京工業大學的王玉珍（Yuzhen Wang）副研究員和廈門大學的林友輝（Youhui Lin）副教授。

CRISPR-Cas9基因編輯工具是治療遺傳疾病的一場即將到來的革命，科學家們繼續在各種應用中測試它的能力。鑒於當前的方法使用病毒將這種基因編輯工具遞送到特定細胞中，一個研究領域涉及尋找它的替代載體系統。人們較早地就已知道這種病毒遞送方法不可行，這是因為免疫系統可能會做出反應，或者更糟的是，這存在著觸發腫瘤產生的風險。在這項新的研究中，中國研究人員提出了一種全新的方法：利用兩種光來遞送這種基因編輯工具。

他們的載體系統由對低能近紅外輻射（NIR）敏感並發出紫外光的上轉換納米顆粒（upconversion nanoparticle, UCNP）組成。當近紅外光照射在這些上轉換納米顆粒上時，這種光被吸收並轉換成紫外光，所產生的紫外光會發射出去。

在細胞內部，這種載體系統可通過給皮膚照射近紅外光加以激活。照射的近紅外光穿過皮膚進入體內，並前去尋找這種載體系統。當近紅外光被上轉換納米顆粒轉化為紫外光時，它切割這種載體系統中的分子，從而釋放出這種基因編輯工具來完成它的作用。

在實際的實驗中，這些研究人員通過注射將CRISPR-Cas9工具直接遞送至小鼠內部的癌性腫瘤中。當它安全就位時，他們將近紅外光照射到位於腫瘤（和基因編輯工具）所在部位上方的皮膚上。當所產生的紫外光釋放出這種基因編輯工具時，它開始編輯一種允許腫瘤生長的蛋白，最終結果就是腫瘤尺寸減小。

這些研究人員表示，他們的研究不僅表明一種基於光的載體能夠與CRISPR-Cas9基因編輯一起發揮作用，而且還表明它能夠安全地發揮作用並且提供直接的益處。

Nature：開發出Cas9-MMEJ可編程基因編輯方法，有望治療143種由DNA微重複引起的疾病

在一項新的研究中，來自美國馬薩諸塞大學醫學院的研究人員開發出一種利用CRISPR-Cas9和一種很少使用的DNA修復途徑編輯和修復一種特定類型的與微重複（microduplication）相關的基因突變。這種可編程基因編輯方法克服了之前在基因校正中所遭遇的低效率。相關研究結果於2019年4月3日在線發表在Nature期刊上，論文標題為「Precise therapeutic gene correction by a simple nuclease-induced double-stranded break」。

論文共同通訊作者、馬薩諸塞大學醫學院分子、細胞與癌症生物學教授Scot A. Wolfe博士說，「這就像擊中重置按鈕（reset button）一樣。我們不需要添加任何校正性的遺傳物質，而是細胞將DNA重新拼接在一起，並移除微重複。這是基因校正的捷徑，具有潛在的治療吸引力。」

微重複是染色體發生變化而使得 DNA上的小片段被拷貝或複製。在某些基因中，當添加的核苷酸數量不能被3整除時，這些微重複就能夠導致所謂的「移碼突變」。這改變了基因向蛋白的翻譯，從而導致功能喪失。由微重複引起的移碼突變導致多達143種不同的疾病，包括肢帶肌營養不良（limb-girdle muscular dystrophy）、赫曼斯基-普德拉克綜合征（Hermansky-Pudlak syndrome）和家族黑蒙性白痴病（Tay-Sachs）。

Wolfe博士是CRISPR-Cas9和其他基於可編程核酸酶的基因編輯方法的專家。大多數這些技術都需要在缺陷基因處產生DNA鏈斷裂並引入校正性的遺傳物質。將新序列插入到DNA斷裂中，並通過在細胞中發現的一種稱為同源介導修復（homology-directed repair, HDR）的的先天性DNA修復機制進行修復。儘管在治療上有希望，但是這種校正基因的方法是低效的並且具有其他的技術挑戰。

Wolfe和論文共同通訊作者、馬薩諸塞大學醫學院威爾斯通肌肉營養不良中心主任、神經學教授Charles P Emerson Jr.博士認為可能存在更為直接的方法來校正由微重複引起的疾病。他們推斷如果微同源介導的末端連接（microhomology-mediated end joining, MMEJ）途徑可以被有效利用，而不是利用同源介導修復途徑，它將會移除重複序列並恢復基因的功能序列。

與其他的細胞修復機制相比，MMEJ途徑的效率更低，也更稀有。MMEJ途徑通常會導致DNA斷裂處的兩側發生缺失，而且MMEJ途徑只負責一小部分DNA修復---據一些估計，不到10%的DNA修復。

Emerson博士有一個很有希望的疾病目標，用於評估這種編輯方法的可行性---由TCAP基因中的微重複引起的2G型肢帶肌營養不良（LGMD2G）。Emerson實驗室和Wolfe實驗室構建的釀膿鏈球菌Cas9核酸酶（Strestococcus pyogenes Cas9, SpCas9）靶向TCAP基因的微重複中心附近的DNA斷裂。他們接著利用SpCas9處理了源自LGMD2G患者的多能性幹細胞。正如他們預測的那樣，MMEJ修復機制移除了這種微重複的一個拷貝---有效地將DNA重新拼接在一起，拼接效率非常高，因而去除了突變的遺傳物質並讓這個基因得到恢復，從而能夠產生正常的TCAP蛋白。

Emerson說，「對TCAP基因微重複進行基因編輯的簡單性和高效性是一個非常激動人心的發現時刻，這就為當前無法治療的LGMD2G開發一種治療方法提供了一個獨特的機會，這已成為我們的近期目標。」

有多少種由微重複引起的疾病可能利用MMEJ核酸酶基因編輯加以治療呢？通過與馬薩諸塞大學醫學院兒科副教授Christian Mueller博士合作，這些研究人員證實與赫曼斯基-普德拉克綜合征1型相關的HPS1基因中的微重複能夠在患者細胞中加以校正。馬薩諸塞大學醫學院神經學助理教授Oliver King博士隨後開發出計算方法來搜索人類基因組資料庫，鑒定出143種與微重複相關的疾病可能能夠利用他們的Cas9-MMEJ方法加以治療。

Wolfe說，「從這樣一個平常的開始，我們相信這種基於MMEJ的治療策略的簡單性、可靠性和有效性可能允許為許多當前無法治療的疾病開發出基於核酸酶的基因校正療法。」

Cell：操縱SKN-1A的蛋白序列編輯有望治療阿爾茨海默病等神經退行性疾病

doi:10.1016/j.cell.2019.03.035.

在一項新的研究中，來自美國麻省總醫院的研究人員發現細胞通過編輯一種關鍵的感測蛋白的氨基酸序列來感知蛋白酶體功能障礙並以一種之前未描述的方式作出反應的機制。相關研究結果發表在2019年4月18日的Cell期刊上，論文標題為「Protein Sequence Editing of SKN-1A/Nrf1 by Peptide:N-Glycanase Controls Proteasome Gene Expression」。

作為一種降解不需要的或者有缺陷的蛋白的細胞組分，蛋白酶體由約20種蛋白組成，這些蛋白形成一種結構，在這種結構中，不需要的細胞蛋白以一種以受到高度調節的方式被處理掉。蛋白酶體功能障礙可導致異常蛋白的沉積，這種異常蛋白的沉積是阿爾茨海默病等神經退行性疾病的特徵，也可在正常衰老中觀察到。

為了應對蛋白酶體功能障礙，健康細胞增加蛋白酶體的蛋白組分的產生。兩年前，麻省總醫院的Gary Ruvkun博士和Nicolas Lehrbach博士已鑒定出包括轉錄因子SKN-1A在內的一系列感測和信號傳導蛋白允許秀麗隱桿線蟲中的細胞檢測蛋白酶體功能障礙並對此作出反應。在這項新的研究中，Ruvkun及其團隊描述了SKN-1A及其哺乳動物同源蛋白Nrf1是如何通過添加一種稱為聚糖的糖分子進行修飾的，這種修飾在細胞分泌的蛋白中是比較常見的，但在DNA結合調控蛋白中是很少見的。

在正常情況下，SKN-1A/Nrf1被蛋白酶體有效降解，這就使得這種蛋白成為蛋白酶體功能的一種天然的監測者。如果蛋白的過量聚集超過蛋白酶體的處理能力，那麼SKN-1A/Nrf1就不會遭受完全降解，就與蛋白酶體基因附近的DNA結合，從而誘導額外的蛋白酶體產生直到這種蛋白再次被充分降解。

2016年，Lehrbach和Ruvkun已證實SKN-1A/Nrf1的活化需要對這種蛋白進行酶促切割以及添加和隨後去除聚糖分子。但是，這些事件的功能意義尚不清楚。在這項新的研究中，他們發現這種從SKN-1A中移除聚糖分子的蛋白--- PNG-1---不僅移除了這些聚糖分子，而且還編輯了SKN-1A中的氨基酸序列：將4個天冬醯胺殘基轉化為天冬氨酸。如果將天冬醯胺轉化為一種不同的氨基酸，那麼SKN-1A就會出現功能障礙。在PNG-1不存在下，通過基因手段導入天冬氨酸分子也可激活SKN-1A，這表明這種蛋白序列編輯而不是去糖基化是SKN-1A發揮功能的關鍵。這種新發現的通過氨基酸序列編輯控制蛋白酶體功能的機制代表了內源性蛋白的一種前所未有的翻譯後修飾。

這些研究人員還發現，通過基因工程手段讓SKN-1A過度活化，因而在遺傳上將4個去糖基化的天冬醯胺改變為天冬氨酸，這對蛋白酶體維持和抗逆性產生顯著影響。過度活躍的SKN-1A賦予對蛋白酶體抑製劑的極強抵抗力，並有效地「治癒」阿爾茨海默病線蟲模型。

這些研究人員指出這一發現在癌症、衰老、神經退行性疾病和一種罕見的涉及蛋白NGLY1（線蟲蛋白PNG-1的人類同源蛋白，它影響著很多神經細胞的功能）突變的人類疾病中具有重要的應用。在這項新的以秀麗隱桿線蟲為研究對象的研究中，他們取得的發現表明這種人類疾病還涉及未能將Nrf1中的糖分子修飾的天冬醯胺編輯成天冬氨酸，從而使得蛋白酶體未能對蛋白聚集做出反應。採取對這些天冬醯胺進行預編輯的干預措施可能重新激活受影響患者的蛋白酶體基因。

Lehrbach說，「迄今為止，我們還不明白為何SKN-1A/Nrf1的序列編輯是它調節蛋白酶體基因表達所必需的。更深入的機制理解可能有助於開發治療NGLY1缺乏症和其他神經退行性疾病的方法。尋找受到去糖基化依賴性序列編輯調控的其他蛋白也將是令人關注的。」

Nature：震驚！CRISPR鹼基編輯器能夠誘導大量的脫靶RNA編輯

在一項新的研究中，來自美國麻省總醫院、哈佛醫學院和哈佛大學陳曾熙公共衛生學院的研究人員報道近期開發的幾種在單個DNA鹼基中產生靶向變化的鹼基編輯器能夠在RNA中誘導廣泛的脫靶效應。他們還描述了對鹼基編輯器變體進行基因改造可顯著降低RNA編輯的發生率，這同時也會增加在靶DNA編輯的精確度。相關研究結果於2019年4月17日在線發表在Nature期刊上，論文標題為「Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors」。

論文通訊作者、麻省總醫院病理學系的J. Keith Joung博士說道，「大多數關於脫靶基因編輯的研究都集中在DNA上，但是我們發現這種技術也可以誘導大量的RNA改變。這一令人吃驚的發現表明，當考慮鹼基編輯器在細胞中的不想要的脫靶效應時，需要考慮的不僅僅是基因變化。我們還發現構建選擇性地降低脫靶RNA編輯同時保留想要的在靶DNA編輯的變體來減少這些影響是可行的。」

與CRISPR-Cas基因編輯核酸酶---它誘導靶雙鏈DNA斷裂，從而導致基因變化---不同的是， CRISPR鹼基編輯器能夠改變DNA鏈中的單個核苷酸而不用誘導這種雙鏈DNA斷裂。Joung解釋道，如果可以將CRISPR-Cas核酸酶比作為剪刀，那麼就可將鹼基編輯器比作為鉛筆。當使用CRISPR-Cas修飾形式的融合蛋白靶向結合到目標位點上時，鹼基編輯器使用一種稱為脫氨酶的酶修飾一個特定核苷酸，從而產生可導致特定DNA改變的變化---比如，將胞嘧啶改變為胸腺嘧啶。

雖然大多數科學家都專註於鹼基編輯器的DNA編輯活性，但是最常用的胞嘧啶胸腺嘧啶編輯器（CT編輯器）中的脫氨酶最初是因它的修飾RNA的能力而被鑒定出的。這導致Joung及其團隊研究它是否可能誘導脫靶RNA效應。他們在肝臟和胚胎腎細胞系中的實驗表明，雖然他們測試的這種常用的鹼基編輯器在靶DNA位點上誘導高效的編輯，但是它也導致整個轉錄組---在細胞中發生轉錄的全部RNA---中發生數萬個胞嘧啶尿嘧啶（CU）編輯。當測試一種較新的腺嘌呤靶向鹼基編輯器時，他們發現了類似的結果。

為了研究減少或消除不需要的RNA編輯的可能性，Joung團隊篩選了16種具有脫氨酶改造版本的鹼基編輯器（即鹼基編輯器改造版本），從中鑒定出兩種鹼基編輯器改造版本與它們的原始版本同樣高效地誘導在靶DNA編輯，同時誘導顯著少的RNA編輯。實際上，這些SECURE（SElective Curbing of Unwanted RNA Editing, 選擇性抑制不需要的RNA編輯）變體甚至要比未經基因改造的脫氨酶更精確地誘導所需的DNA編輯。

論文第一作者Julian Grünewald博士說，「我們利用這兩類鹼基編輯器觀察到的數以萬計的RNA編輯和這些變化發生的頻率感到非常吃驚。我們也很高興看到我們能夠通過使用我們的SECURE鹼基編輯器變體大幅降低這些不需要的RNA編輯。」

Joung指出，研究這些RNA編輯對CRISPR鹼基編輯的實驗和臨床應用的任何潛在影響是他的團隊正在採取的重要下一步。「我們發現，我們研究的這種廣泛使用的胞嘧啶鹼基編輯器當在一種人細胞系中表達時對細胞活力具有適度的影響，而SECURE變體則不會。對研究應用而言，正在使用鹼基編輯器的科學家們將需要在他們的實驗中考慮潛在的RNA 脫靶效應。對治療性應用而言，我們的研究結果進一步論證了將鹼基編輯器表達的持續時間限制在儘可能短的時間內，以及在安全評估中考慮RNA 脫靶效應的潛在影響並使之最小化的重要性。」

Joung補充道，「正在開展的研究工作的另一個重要領域是擴大我們的努力，以盡量減少這些不需要的脫靶RNA編輯。我們當前正在嘗試設計SECURE腺嘌呤鹼基編輯器並探索使用其他脫氨酶的而不是我們研究的鹼基編輯器中使用的脫氨酶的胞嘧啶鹼基編輯器的脫靶RNA效應。我們的目標是產生一套具有最小RNA編輯活性的鹼基編輯器，從而可用於研究和治療性應用。

JEM：利用CRISPR/Cas9對B細胞進行基因編輯有望開發出HIV疫苗

DOI: 10.1084/jem.20190287.

人體不能自然地保護自己免受HIV病毒感染---至少通常不能做到這一點。但是，在極少數情況下，受感染的個體會產生對抗這種病毒的廣泛中和抗體（bNAb）。如今，在一項新的研究中，來自美國洛克菲勒大學的研究人員設計出一種方法，將這種對抗HIV的能力賦予給普通的免疫細胞。相關研究結果於2019年4月11日在線發表在Journal of Experimental Medicine期刊上，論文標題為「HIV-specific humoral immune responses by CRISPR/Cas9-edited B cells」。論文通訊作者為洛克菲勒大學的Michel C. Nussenzweig博士。

Nussenzweig在bNAb上的研究已產生了新的在早期臨床試驗中顯示出前景的HIV治療方法。如今，他著眼於第二個目標：針對這種病毒的免疫接種。

在這項新的研究中，Nussenzweig和他的同事們使用CRISPR-Cas9基因編輯技術來修飾B細胞，即一種分泌抗體的白細胞。具體而言，他們對小鼠B細胞進行基因改造，使得它們自己產生人bNAb。他們發現，以這種方式發生改變的B細胞產生的抗體水平足以保護小鼠免受HIV感染，這表明這種技術最終可能用作一種免疫工具。

雖然這項研究仍處於早期階段，但是它證實了通過基因編輯增強免疫應答的可行性。重要的是，這種技術不會影響生殖細胞，因而避免了有時由CRISPR干預引起的倫理問題。如果能夠實現，這種新的免疫方法不僅可以用於治療HIV感染，而且還可以用於治療任何對特定抗體敏感的疾病。

Blood：利用CRISPR-Cas12a基因編輯有望治療β-地中海貧血

doi:10.1182/blood-2019-01-895094.

在一項新的研究中，來自美國達納法伯癌症研究所、波士頓兒童醫院和馬薩諸塞大學醫學院等研究機構的研究人員通過將CRISPR-Cas12a基因編輯應用於患者自己的造血幹細胞中，開發出一種治療一種最為常見的遺傳性血液疾病---β-地中海貧血---的策略。這種方法克服了之前的技術挑戰，而且要比過去更有效地對造血幹細胞進行編輯。相關研究結果近期發表在Blood期刊上，論文標題為「Editing aberrant splice sites efficiently restores β-globin expression in β-thalassemia」。論文第一作者為Shuqian Xu。論文通訊作者為Daniel Bauer博士和Scot Wolfe博士。

這新的研究發現這些經過基因編輯的造血幹細胞產生得到基因校正的紅細胞，因而能夠產生功能性的血紅蛋白。

兩篇論文的論文通訊作者Daniel Bauer博士說，「我們認為我們的研究確定了一種可能治癒常見的血紅蛋白疾病的策略。將基因編輯與自體幹細胞移植結合在一起可能是一種治療鐮狀細胞病、β-地中海貧血和其他血液疾病的方法。」

根據世界衛生組織（WHO）的統計，鐮狀細胞病和β-地中海貧血每年在世界範圍內共影響33.2萬人懷孕或分娩。這兩種疾病都涉及β珠蛋白編碼基因發生突變。在β-地中海貧血中，突變阻止紅細胞產生足夠多的攜氧血紅蛋白分子，從而導致貧血。在鐮狀細胞病中，突變導致血紅蛋白改變形狀，使得紅細胞變形為僵硬的「鐮刀」形狀，從而阻塞血管。

在這項新的研究中，這些研究人員使用一種類似於CRISPR-Cas9的基因編輯方案來靶向涉及剪接突變---在β-珠蛋白編碼基因附近的DNA片段出現差錯改變讀取這個基因以組裝β-珠蛋白的方式---的β-地中海貧血形式。9名β地中海貧血患者捐獻了他們的造血幹細胞，這樣就可在培養皿中操縱它們。對於其中的一些患者，這些研究人員利用另一種不同的酶--- Cas12a---來更高效地靶向這些突變。CRISPR/Cas12a高效地進行基因編輯並恢復了來自每名患者的血細胞中β-珠蛋白編碼基因的正常剪接。

為臨床試驗做準備

Bauer認為繼續追求這種方法很重要。他說，「這些疾病是非常常見的遺傳性疾病，特別是在世界上資源非常有限的地區。因此，我們需要一系列廣泛的治療選擇，以便為儘可能多的患者提供治療。」

波士頓兒童醫院是生物技術公司藍鳥生物（BlueBird Bio）的股權持有者，而且一些作者申請了與治療性基因編輯相關的專利。

如果這種處於研究中的技術經證實是有益的，那麼波士頓兒童醫院可能會獲得經濟利益。與所有研究一樣，波士頓兒童醫院已採取並將繼續採取一切必要措施，以確保研究對象的安全性，以及本研究所獲得信息的有效性和完整性。

Nat Med：優化的CRISPR-Cas9基因編輯有望治療鐮狀細胞病

在一項新的研究中，來自美國達納法伯癌症研究所、波士頓兒童醫院和馬薩諸塞大學醫學院等研究機構的研究人員通過將CRISPR-Cas9基因編輯應用於患者自己的造血幹細胞中，開發出一種治療一種最為常見的遺傳性血液疾病---鐮狀細胞病（sickle cell disease）---的策略。這種方法克服了之前的技術挑戰，而且要比過去更有效地對造血幹細胞進行編輯。相關研究結果於2019年3月25日在線發表在Nature Medicine期刊上，論文標題為「Highly efficient therapeutic gene editing of human hematopoietic stem cells」。論文通訊作者為Daniel Bauer博士，論文第一作者為Yuxuan Wu和Jing Zeng。

這項新的研究發現這些經過基因編輯的造血幹細胞產生得到基因校正的紅細胞，因而能夠產生功能性的血紅蛋白。

Bauer說，「我們認為我們的研究確定了一種可能治癒常見的血紅蛋白疾病的策略。將基因編輯與自體幹細胞移植結合在一起可能是一種治療鐮狀細胞病、β-地中海貧血和其他血液疾病的方法。」

根據世界衛生組織（WHO）的統計，鐮狀細胞病和β-地中海貧血每年在世界範圍內共影響33.2萬人懷孕或分娩。這兩種疾病都涉及β珠蛋白編碼基因發生突變。在β-地中海貧血中，突變阻止紅細胞產生足夠多的攜氧血紅蛋白分子，從而導致貧血。在鐮狀細胞病中，突變導致血紅蛋白改變形狀，使得紅細胞變形為僵硬的「鐮刀」形狀，從而阻塞血管。

這項新的研究使用了CRISPR-Cas9技術，特別是馬薩諸塞大學醫學院的Scot Wolfe博士領導的一個研究團隊進行基因修飾過的Cas9蛋白，來優化基因編輯。在之前對人造血干/祖細胞的基因組進行編輯的嘗試中，一旦將這些基因編輯的細胞植入骨髓中，基因編輯的效率、特異性和長期穩定性就會發生變化。這種新技術提高了基因編輯的靶向性和持久性。

Wolfe說，「對造血幹細胞群體進行高效編輯---理想情況下接近100％---對在患者中實現持久的治療效果至關重要。通過科學界多個實驗室的貢獻，朝著這一目標的進展一直在推進。我的研究團隊與Bauer實驗室合作，致力於提高CRISPR-Cas9技術的遞送和進入細胞核效率，以便實現對整個造血幹細胞群體的近乎徹底的治療性編輯。」

Bauer團隊使用這種策略進行高度針對性的基因編輯。之前在波士頓兒童醫院的研究已表明，讓一種名為BCL11A的基因失活允許紅細胞即便在出生後也會繼續產生胎兒形式的血紅蛋白。胎兒血紅蛋白不會產生鐮刀形狀，能夠代替有缺陷的「成年」血紅蛋白。最近，Bauer發現了一個更安全的靶標：BCL11A基因的增強子，僅在紅細胞中有活性。

Bauer說，「通過使用我們開發的這種新型的非常有效的方法，我們能夠在我們收集的幾乎所有的造血幹細胞中對BCL11A的增強子進行編輯，從而克服了對這些細胞進行基因編輯所面臨的一些技術挑戰。在我們的實驗中，95%以上的增強子序列拷貝以我們期望的治療方式發生改變。」

這種策略使得攜帶來自鐮狀細胞病患者的造血幹細胞的小鼠能夠產生具有足夠的胎兒血紅蛋白的紅細胞，從而阻止紅細胞產生鐮刀形狀。Bauer團隊發現這些經過基因編輯的造血幹細胞在移植到骨髓中後產生得到基因校正的紅細胞。隨後，當從這些小鼠中分離出造血幹細胞並移植到其他小鼠中時，這些造血幹細胞再次定植並且仍然攜帶治療性的基因變化。

當將這一策略應用於來自β-地中海貧血患者的造血幹細胞時，它恢復了構成血紅蛋白的珠蛋白鏈的正常平衡。

為臨床試驗做準備

這些研究人員正在採取措施將他們開發的BCL11A增強子編輯策略應用於臨床。他們正在開發一種臨床級、規模化的細胞產品製造方案，並進行獲得美國食品藥品管理局（FDA）批准所必需的安全性研究。他們計劃從美國心肺血液研究所的鐮狀細胞病治癒計劃中尋求資金資助，以便在患者中開展臨床試驗。

達納法伯癌症研究所/波士頓兒童醫院癌症血液疾病中心已開始進行對鐮狀細胞病進行基因治療的臨床試驗。該方法通過將患者的造血幹細胞暴露在一種攜帶著指令的慢病毒中來抑制紅細胞前體細胞中的BCL11A基因表達，從而增加胎兒血紅蛋白的產生。

Bauer認為繼續追求這種方法很重要。他說，「這些疾病是非常常見的遺傳性疾病，特別是在世界上資源非常有限的地區。因此，我們需要一系列廣泛的治療選擇，以便為儘可能多的患者提供治療。」

波士頓兒童醫院是生物技術公司藍鳥生物（BlueBird Bio）的股權持有者，而且一些作者申請了與治療性基因編輯相關的專利。

如果這種處於研究中的技術經證實是有益的，那麼波士頓兒童醫院可能會獲得經濟利益。與所有研究一樣，波士頓兒童醫院已採取並將繼續採取一切必要措施，以確保研究對象的安全性，以及本研究所獲得信息的有效性和完整性。

bioRxiv：成功利用CRISPR-Cas9對爬行動物進行基因編輯

doi:10.1101/591446.

在一項新的研究中，來自美國喬治亞大學的研究人員發現一種可在爬行動物身上使用CRISPR-Cas9基因編輯工具的方法。相關研究結果近期發表在bioRxiv預印版伺服器上，論文標題為「CRISPR-Cas9 Gene Editing in Lizards Through Microinjection of Unfertilized Oocytes」。在這篇論文中，他們描述了他們開發的這種技術，以及它在測試的蜥蜴中的效果。

隨著科學家們試圖更多地了解CRISPR-Cas9本身、它的工作機制及其潛在的應用，它已被用於各種各樣的實驗。不過，在早期，科學家們認為CRISPR不能與爬行動物一起使用，這是因為爬行動物具有獨特的生殖系統---比如，雌性蜥蜴儲存精子，僅在最方便的使用加以使用，這就使得注射CRISPR-Cas9工具較為困難（如果不是不可能的話）。此外，還存在將針插入卵殼而不損壞它和阻止胚胎髮育的問題。但是，存在困難並未意味著不可能，正如這些研究人員發現的那樣，他們開發出一種成功的解決方法：利用CRISPR-Cas9對幾隻蜥蜴中的細胞進行基因編輯。

為了在蜥蜴中使用CRISPR-Cas9，這些研究人員切開了幾隻測試的雌性蜥蜴並在受精前將這種編輯工具直接注射到卵子中，同時這些卵子仍然存在於母體的卵巢中，然後順其自然發育。總之，他們將這種編輯工具注射到21隻蜥蜴的146個卵子中。在他們的實驗中，CRISPR-Cas9經編程後對酪氨酸酶編碼基因進行編輯，其中這個基因負責確定蜥蜴的顏色---當它受到失活時，蜥蜴將患上白化病（albino）。他們報道，這種編輯技術成功了四次---4隻患有白化病的蜥蜴出生了。他們指出他們的技術應當也適用於其他種類的蜥蜴。

在仔細研究患上白化病的蜥蜴中實際發生的情形之後，這些研究人員發現這些蜥蜴後代具有來自父本和母本的經過編輯的基因---這意味著CRISPR-Cas9在雌性蜥蜴中保持活性的時間比預期中的要長，從而導致父本基因在受精後的變化已經發生了。

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