Nature：中國科學院、川大合作新成果！DNA鹼基編輯器或能誘導大量脫靶RNA突變！

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近日，一項刊登在國際雜誌Nature上的研究報告中，來自中國科學院和四川大學等機構的科學家們通過研究發現，DNA鹼基編輯器能夠產生成千上萬個脫靶的RNA單核苷酸變異（SNVs），同時通過將點突變引入脫氨酶或能消除這些脫靶的SNVs；本文研究揭示了此前DNA鹼基編輯器風險中被忽略的一方面，同時研究者通過引入工程化的脫氨酶或有望解決這一問題。

DNA鹼基編輯方法能夠直接在基因組DNA中進行點突變的校正，同時並不會產生任何雙鏈的斷裂（DSBs，double-strand breaks），但潛在的脫靶效應常常限制了這些方法的應用，腺相關病毒（AAV）是DNA編輯基因療法中最常用的傳遞系統，由於這些病毒能夠在體內持續維持基因表達的功能，因此DNA鹼基編輯器所誘導的潛在RNA脫靶效應的程度在臨床中得到了極大的關注。

此前多項研究都評估了因DNA鹼基編輯器所誘導的基因組DNA脫靶突變，同時常用的DNA鹼基編輯器所必須的脫氨酶通常會表現出DNA的結合活性，比如，胞嘧啶鹼基編輯器（CBEs）中所使用的胞嘧啶脫氨酶APOBEC1能夠靶向作用DNA和RNA，而腺嘌呤鹼基編輯器（ABEs）中的腺嘌呤脫氨酶TadA則會誘導RNA上的位點特異性肌苷形成，然而DNA鹼基編輯器所誘發的任何潛在RNA突變，研究人員並未進行評估。

為了在RNA水平下評估DNA鹼基編輯器所引發的脫靶效應，研究人員計算了每個CBE和ABE處理的細胞中每次複製產生的脫靶RNA SNVs的數量，並通過工程化的DNA鹼基編輯器脫氨酶來探索是否能夠有效消除脫靶RNA SNVs。文章中，研究者將BE3 (APOBEC1-nCas9-UGI)（一種CBE）、ABE7.10 (TadA-TadA*-nCas9)(一種ABE)及攜帶或不攜帶單鏈RNA的GFP轉染到HEK293T培養的細胞中，在證實了BE3和ABE7.10對HEK293T細胞的DNA高效編輯效率後，研究者以平均125X的深度對樣本進行了RNA測序，並定量評估了每個複製細胞中的RNA SNVs。

為了保證高效的編輯，每個CBE或ABE處理的細胞複製體都要評估其目標編輯效率，隨後研究者將兩組的脫靶RNA SNVs的數量與GFP對照組進行對比，他們發現，在DNA鹼基編輯器處理的細胞中，RNA SNVs數量驚人地高。此外，研究人員還發現，BE3和ABE7.0處理的細胞突變偏倚分別與APOBEC1和TadA的突變偏倚相同，這就說明，脫靶效應或許是DNA鹼基編輯器的過表達所引起的，此外研究者還在這些脫靶的RNA SNVs中鑒別出了CBE和ABE特異性的基序和遺傳區域。

為了消除鹼基編輯器的RNA脫靶活性，研究者還分析了引入點突變對APOBEC1和TadA的影響效應，他們發現，三個高保真的變異：BE3W90Y R126E， BE3 (hA3AR128A) and BE3 (hA3AY130F)能夠在基準水平上降低RNA脫靶SNVs的水平，同樣地，ABE突變ABE7.10F148A還能夠完全消除脫靶效應。

這項研究中，研究人員通過在脫氨酶中引入點突變獲得了CBEs和ABEs的高保真變異，並提出了一種新方法，通過利用工程化操作手段來提高鹼基編輯器的特異性。

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