《Science Advances》Highlights重磅！應用賽特SE-iFISH揭秘乳腺癌轉移機制

乳腺癌是國內外女性發病率最高的惡性腫瘤，讓無數女性聞之色變。乳腺癌可防可治，早期乳腺癌10年生存率達80%。雖然早期乳腺癌患者的生存率不斷提高，但仍有20-30%的I-III期患者最終會發生腫瘤遠端轉移，進展為晚期腫瘤。晚期乳腺癌患者的5年生存率低於25%，因此，揭示腫瘤轉移的機制，對於進一步提高乳腺癌及其它腫瘤的診療效果具有極其重要的意義。

最近，由上海交通大學附屬上海第一人民醫院腫瘤中心、德國Ludwig Maximilians 大學醫學中心和賽特生物經過長期密切合作，在大量臨床樣本及腫瘤動物模型的基礎上，使用多種技術手段（包括血液CTCs/骨髓DTCs分離與培養；相關腫瘤細胞系及腫瘤動物模型的建立；SE-iFISH CTCs/DTCs檢測；CTCs/DTCs單細胞全基因組擴增與NGS測序等），對乳腺癌轉移機制進行了長期深入研究，並獲得重大發現。在乳腺癌患者體內精確鎖定了腫瘤遠端轉移過程中起主導作用的腫瘤細胞 –EpCAM 小細胞異倍體CTCs與DTCs (≤白細胞)。該項研究成果已剛剛發表在國際頂級的《科學》雜誌子刊《科學·進展》(Science Advances, AAAS) (影響因子IF=12.804)。腫瘤中心王紅霞主任醫師為通訊作者，德國慕尼黑大學Olivier Gires為共同通訊作者。劉嘯和李軍建為共同第一作者。這篇文章同時被選為本期雜誌的亮點文章(Highlight)。

在該雜誌將此重大發現向全球11000多名相關記者發布的同時，我們也在第一時間向國內廣大腫瘤界同行簡要介紹該項重要研究成果。

本文要點

本研究基於大量乳腺癌腫瘤動物模型及臨床標本，鎖定了乳腺癌遠端轉移過程中起主要作用的腫瘤細胞亞類：EpCAM 異倍體小細胞CTCs與DTCs。此類乳腺癌細胞與使用SE-iFISH確定的肝癌患者術後複發過程中起主導作用的CTCs亞類細胞相一致 (Wang et al., 2018 Cancer Lett 412:99)

應用SE-iFISH檢測乳腺癌患者外周血中EpCAM 異倍體小細胞CTCs ，可有效評估腫瘤遠端轉移，而EpCAM 二倍體CTCs 與腫瘤轉移無明顯相關性

乳腺癌患者骨髓中檢出EpCAM 異倍體小細胞DTCs可準確預測患者6個月的較差預後。如果EpCAM 異倍體小細胞DTCs佔DTCs總數 ≥20%，患者的總生存率明顯降低

iFISH CTCs單細胞全基因組擴增及NGS測序顯示，與EpCAM-CTCs相比，EpCAM 異倍體CTCs表現出了多個基因擴增，涵蓋了tight junction、有絲分裂細胞周期、 乳腺上皮細胞分化、乳腺導管形態發生等，提示乳腺癌患者EpCAM CTCs的細胞粘附、增殖、上皮分化能力增加

使用依賴EpCAM的方法檢測CTCs，會嚴重漏檢CTCs總數 (如耐葯CTCs等)，但有可能檢出與轉移相關的CTCs

腫瘤轉移過程中的「漸變EMT」及相應細胞類別

腫瘤細胞在腫瘤轉移過程中經歷「漸變EMT (gradual EMT)」，此過程中細胞表面EMT標識物的表型也隨之不斷變化，形成不同類別的腫瘤細胞：包括上皮型(E)、上皮型為主/間質混合型 (E/m)、間質型為主/上皮混合型 (M/e)及間質型 (M)。M型的腫瘤細胞浸潤血管(intravasation)能力最強，進入血液後即為CTCs。CTCs可在特定器官(如肺、肝臟、骨髓等)穿出血管(extravasation)，形成播散性腫瘤細胞(disseminated tumor cells, DTCs)，並進一步形成腫瘤轉移灶。

本文研究人員首先使用4T1乳腺癌細胞藉助同源移植技術，建立了4T1小鼠腫瘤動物模型。從腫瘤模型中分離出血液CTCs及骨髓DTCs，經過細胞培養後形成相應的細胞系CTC1 及 DTC1。進一步的蛋白表達(免疫組化、流式細胞儀)及mRNA檢測發現，與上皮型(E) 4T1細胞相比，CTC1為間質型(M)，表達Vimentin 與CK，但卻丟失了所有上皮表型蛋白EpCAM及E-Cadherin；而DTC1 為混合型(E/m)，含有大量上皮型(E)及少量間質型(m) 腫瘤細胞。

不同EMT蛋白表型的腫瘤細胞成瘤能力檢測

一系列腫瘤細胞成瘤能力(tumorigenic abilities) 實驗證明，CTC1細胞具有最強的生長(3D-colony)、遷移(migration)及浸潤(invasion)能力，而DTC1具有與血管內皮細胞最強的粘附(adhesion)能力。相比4T1細胞而言，CTC1與DTC1的生長、遷移及浸潤能力均有較大增加。

作者將培養後的DTC1細胞接種BALB/C鼠，成瘤後經富集、培養分別獲得了26株DTC1 衍生的CTCs亞細胞系(sublines)和10株DTCs亞細胞系。這些亞細胞系涵蓋了EMT所有表型，包括E, E/m, M/e及M。成瘤能力實驗證實，E/m表型的CTCs 亞細胞系，無論是與血管內皮細胞的粘附能力，還是浸潤能力均高於M/e 表型的腫瘤細胞。

E/m型CTCs具有最高的腫瘤轉移能力

為了確定EMT中哪類細胞具有最高的腫瘤轉移能力，作者將上述E, E/m, M/e和M型細胞接種於Balb/c鼠，19天後計數肺轉移灶數目。結果顯示，與間質型(M/e, M) CTCs相比，上皮型(E, E/m) CTCs具有更高的轉移指數 (metastatic index/cell)，其中E/m 型CTCs具有最高的轉移指數。

SE-i·FISH檢測乳腺癌患者血中CTCs及骨髓中DTCs

為了進一步驗證上述在腫瘤動物模型中得到的「EpCAM CTCs及DTCs具有較高轉移能力」的實驗結論，作者使用SE-iFISH技術，對34例確診為乳腺癌轉移的病人進行了血液CTCs、骨髓DTCs及相應細胞團的染色體核型與EpCAM蛋白表型的同步原位檢測。結果顯示，骨髓中的DTCs細胞團數目明顯高於血中的CTCs細胞團。

染色體核型、EpCAM蛋白表型、細胞形態三位一體分析CTCs與DTCs

為了對CTCs與DTCs 進行全面分析，以確定患者體內具有特定臨床意義(如與腫瘤轉移相關)的亞類細胞，作者使用SE-iFISH技術，從細胞內生物鏈(cellular bio-chain)角度，對所有從患者體內檢測出的CTCs及DTCs進行了全面系統性分析。

鑒於細胞內生物鏈三要素「DNA-mRNA-蛋白質」中的mRNA屬於不穩定的中間過渡性產物，不像蛋白質那樣具備直接調節細胞的功能，且DNA擴增或mRNA陽性因受「翻譯」與「轉錄」等調控點的調節，未必導致相應蛋白的陽性表達(Luoh, et al., 2013 Springerplus 2:386)。因此，作者選擇了早已被廣為接受的針對腫瘤細胞的染色體數目異常和EpCAM的蛋白表達進行檢測，而mRNA 不在考量範圍之內。

結果顯示：1） 乳腺癌轉移患者外周血中EpCAM CTCs檢出率為41.2%，佔CTC細胞總數的 22.4%；骨髓中EpCAM DTCs的患者陽性檢出率為64.7%，佔DTC細胞總數的 65.9%；2）病人CTCs多為間質型，而DTCs 多為上皮型；3）CTCs中8號染色體三倍體及 ≥5 倍體的細胞占多數，分別為36.6% 及30.4%，而DTCs中占多數的分別是四倍體(36.3%) 及三倍體(28.6%)；4）無論CTCs 還是DTCs，小細胞(≤白細胞)均佔大多數，分別為62.13% 和95.89%。此結果也再次證實了採用細胞孔徑過濾去除白細胞以試圖分離腫瘤細胞的方法具有很大的局限性。

i·FISH CTC單細胞NGS測序

為了比較EpCAM 與EpCAM-CTCs在基因水平的異同，作者利用「非激光單細胞分離系統 NMSCM」對來自3個腫瘤患者的10個EpCAM CTCs及20個EpCAM-CTCs分別進行了單細胞挑取、全基因組擴增、建庫及二代測序。測序數據結果分析顯示，與患者各自的白細胞相比，兩類細胞存在657個擴增或缺失的CNV差異，覆蓋了1255個編碼基因(coding genes)。其中，EpCAM CTCs擴增的基因涉及tight junction (CLDN3, STRN, PTPN13)、有絲分裂細胞周期(CCNB1, SHB, EIF4EBP1, DUSP3, ABL1)、 乳腺上皮細胞分化(ERBB4)、乳腺導管形態發生(GLI2, CSF1R)等方面，進一步提示腫瘤患者EpCAM CTCs的細胞粘附、增殖、上皮分化能力增加。

SE-i·FISH檢測出的不同蛋白表型CTCs與DTCs亞類細胞的臨床意義

作者對SE-iFISH 檢測出的不同蛋白表型的異倍體CTCs和DTCs在乳腺癌病人中的臨床意義做了深入研究， 發現EpCAM CTCs 、DTCs在各自總數中所佔比例與患者腫瘤遠端轉移密切相關(M1)，尤其是EpCAM DTCs相關性更大。EpCAM DTCs所佔比例可以較準確預測乳腺癌轉移患者的總生存率(OS) ，以ROC曲線分析得到cut-off值為20%，骨髓中EpCAM DTCs在DTCs總數中的比例≥20%， 患者總生存率顯著下降。

結 論

1. 根據本研究實驗結果，乳腺癌轉移的主要機理(包括參與的主要細胞及途徑)為：腫瘤細胞自原發灶脫落，經EMT及血管內滲作用後入血形成CTCs。一部分CTCs到達骨髓形成具有很強轉移能力的EpCAM 小細胞DTCs ， 另外一些EpCAM 小細胞異倍體CTCs經血流至遠端器官，外滲穿透出血管，形成遠端轉移灶。本研究首次揭示了EpCAM 異倍體小細胞CTCs在腫瘤轉移過程中的重要作用。

腫瘤轉移模式圖如下：

2. 乳腺癌病人CTCs 與DTCs中的EpCAM 細胞所佔比例與患者的腫瘤遠端定向肺轉移(oligometastasis) 及不良預後密切相關。其中EpCAM DTCs相關性更大，骨髓中EpCAM DTCs 在DTCs總數中所佔比例≥20%， 患者總生存率顯著下降。

3. 臨床常規、無創檢測血液中EpCAM 蛋白陽性表達的異倍體小細胞CTCs，可有效評估、判斷乳腺癌患者的腫瘤遠端轉移，而EpCAM 二倍體CTCs則與腫瘤轉移無明顯相關性。

4. 依賴EpCAM表達的陽性捕獲法會丟失所有EpCAM-CTCs (如與葯敏或耐葯相關的CTCs等)，但有可能分離出與轉移相關的EpCAM CTCs，前提是這些細胞的染色體必須為異倍體。本研究結果同時提示，應用「細胞篩」過濾法會顯著丟失具有遠端轉移能力的小細胞CTCs與DTCs。

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