用突變基因，解碼蛋白質結構

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繪製蛋白質的原子結構對於理解其行為至關重要，但這是一項艱巨的工作，通常需要專業且極其昂貴的大型儀器設備，包括冷凍電鏡、蛋白質結晶自動化工作站等。現在，有兩個獨立的研究團隊報告稱，他們已經找到了一種使用遺傳和生化技術來完成這項工作的方法，這可能會為更多的實驗室打開結構生物學的大門。與在晶體或溶液中將蛋白質可視化的傳統方法不同，這種方法還可以揭示蛋白質在細胞內的自然形態，從而揭示破壞蛋白質功能的突變是如何導致疾病的。

美國華盛頓大學的基因組科學家Douglas Fowler說：「這真是太棒了！新方法雖然不能像標準方法那樣提供完整的原子結構圖譜，但它提供的蛋白質大體形狀卻帶來了與蛋白質功能相關極具價值的線索。此外，這可能會對確定膜結合蛋白或大型複合體的一部分結構產生非常大的影響，而這兩種結構都很難用標準方法研究。」

現如今，最常用確定蛋白質結構的方法是將數百萬份蛋白質複製成有序的晶體，然後用X射線衍射，並追蹤它們的活動以揭示每個原子的特性和位置。核磁共振光譜法和冷凍電鏡法等替代技術也需要大量的蛋白質，而且可能需要花費幾個月時間。在數百萬種被認為存在的蛋白質中，科學家們只解開了其中大約15萬種的結構，而這一過程卻花費了幾十年的時間。

有些研究人員試圖通過簡單地從氨基酸序列和原子間可能的相互作用來預測蛋白質最可能的形狀來加快速度。但這種計算方法的精確程度往往不如實驗方法。最近的一個改進方法是比較多個物種中相同的蛋白質，以發現在蛋白質線性序列中相距很遠但共同進化在一起的氨基酸對。這是個強有力的證據，表明兩個分子關聯緊密，並在摺疊三維分子中相互作用。但美國哈佛醫學院系統生物學家Debora Marks說：「只有當研究人員能夠確定多種生物體共有的蛋白質，且這些蛋白質的差異足以幫助識別共同進化的多種氨基酸對時，這種方法才會奏效。」

現在，由Marks與西班牙巴塞羅那科學技術學院的遺傳學家Ben Lehner領導的另一個研究團隊繞過了對進化幫助的需求，各自提出了在蛋白質中發現相互作用氨基酸的想法，即系統地突變每個氨基酸，並跟蹤這些變化如何改變蛋白質功能，例如與另一個分子結合的能力。

這兩項研究都是建立在由加州大學洛杉磯分校系統生物學家Ren Sun領導的團隊，對名為GB1的細菌蛋白質片段的研究基礎上。2014年，Sun的團隊報告稱創造了超過50萬份GB1基因，每個副本的56個氨基酸中有一到兩個發生了變化。對於所謂的單一突變，研究人員系統地將每一種氨基酸替換為另外19種選擇中的一種。在雙突變體中，它們改變了氨基酸對，幾乎可以完成所有可能的組合。在用這些突變基因培養細菌並分離出蛋白質後，Sun的團隊通過觀察哪些突變體與其天然靶點——人免疫球蛋白G抗體結合得最緊密，從而確定了GB1氨基酸的重要性。

Marks和Lehner的團隊意識到，他們可以將單突變體和雙突變體的數據結合分析，以確定哪些氨基酸的相互作用最強，從而最可能在蛋白質的三維結構中相鄰。Fowler說：「有時我們會看到突變結合起來產生更加顯著的影響。」通過跟蹤幾十次這樣的事件，並將結果輸入到結構預測程序中，該團隊計算出實驗性X射線結構已知的GB1主要骨架形狀，解析度達到了幾埃（angstrom，光譜線波長單位）。

該研究結果近日已發表在《Nature Genetics》上。他們還表明，該技術與其他小蛋白質和具有類似可用數據的RNA協同工作。Fowler指出，對於包含有成百上千種氨基酸的蛋白質來說，這種方法可能更加困難，因為隨著蛋白質的生長，必須產生突變蛋白的數量呈指數級增長。但是Marks很樂觀：早期的跡象表明，這項技術只能解析所有可能突變的一小部分。Lehner的團隊稱，該方法甚至可以對缺乏已知結合靶標的蛋白質進行穩定性測量。

這種方法還有其他優點。今年3月，Lehner和他的團隊將該成果的預印本發表在《bioRxiv》上，他們描述了如何使用一種名為TDP-43的RNA結合蛋白，是如何導致神經退行性疾病肌萎縮側索硬化症(ALS)的。在許多ALS患者屍檢大腦的神經元中已經觀察到TDP-43聚集的不溶性沉積物，所以Lehner團隊製造了5萬多個TDP-43突變體，並追蹤它們在酵母細胞中的毒性。他們發現，他們發現聚集的突變體形式比其他版本的蛋白質毒性低。Lehner說：「這與我們所預料的恰好相反。」他謹慎地指出，無論哪種方法，它都表明，數以千計的突變篩查可以提供對這兩種蛋白質本身及其結構如何影響活細胞健康的新見解。

參考文獻：

1、Inferring protein 3D structure from deep mutation scans

2、Protein structure from experimental evolution

DOI: 10.1101/667790

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