膀胱癌液體活檢的研究進展

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文章導讀

膀胱癌是泌尿系統中最常見的惡性腫瘤，在男性惡性腫瘤中發病率排在第四位，在女性中為第十一位，其發病率也在逐年上升。通常情況下在中後期才能被診斷出來，給患者帶來了巨大的身心傷害。膀胱鏡檢查是膀胱癌診斷的金標準，但這種方法具有一定的侵入性，並且在膀胱癌的早期診斷中，靈敏度和特異性較低，容易出現較高的假陽性率。膀胱癌的發生會對血液和尿液的成分產生直接影響，因此非侵入性的液體活檢將為膀胱癌的早期診斷帶來新的檢測方法。

膀胱癌的標誌物

DNA 生物標誌物包括 DBC1、MYO3A、SOX11、NPTX2、NKX6-2、A2BP1、PENK 和 CA10 等，主要檢測基因甲基化情況。

mＲNA 生物標誌物包含微小 ＲNA-21( miＲNA-21)、存活素 mＲNA( survivin mＲNA) 、透明質酸酶 mＲNA 和尿路上皮特異蛋白mＲNA 等，主要檢測含量變化。

蛋白質生物標誌物包括細胞角蛋白( CK8、CK18、CK19、CK20) 、核基質蛋白( NMP 22) 、膀胱癌特異性核基質蛋白( BLCA-1、BLCA-4) 、細胞凋亡相關蛋白( Bax、BCL-2、Caspase-3、XIAP) 、基質金屬蛋白( MMP-9、MMP-7) 、血管內皮生長因子( VEGF) 、組蛋白脫乙醯酶抑製劑M344、膀胱腫瘤細胞相關黏蛋白( LDQ10、19A211) 、白細胞介素( IL-1α、IL-6、IL-8) 、趨化因子、β-肌動蛋白( β-actin) 、上皮細胞粘附分子( EpCAM) 、纖連蛋白、甲基轉移酶、端粒酶( telomerase) 、存活素( survivin) 和活素( livin) 等，主要檢測含量變化及活性改變等情況。

其它生物標誌物包括染色體9p21、血清素、褪黑激素、透明質酸( HA) 、纖維蛋白降解產物( FDP) 、色氨酸及其代謝產物等。

對不同標誌物進行同時檢測可以提高診斷準確性。同時，由於不同階段腫瘤表達的標誌物種類和含量不同，對不同的腫瘤標誌物進行檢測可以對腫瘤進行分期和分級，以便在不同的發展階段採用不同的治療手段，設計個性化的醫療方案。因此，不同的研究團隊也基於不同種類的標誌物開發出了多樣的檢測方法，其中主要包括UV-Vis 吸收光譜、熒光光譜、電化學發光、電化學感測、聚合酶鏈反應( PCＲ) 和凝膠電泳。

基於 UV-Vis 吸收光譜的檢測手段

UV-Vis 吸收光譜是基於價電子的躍遷而產生對紫外可見波段的光吸收，根據光吸收程度可以對物質的組成、含量和結構進行分析、測定和推斷。基於 UV-Vis 吸收光譜的膀胱癌生物標誌物分析方法主要是與酶聯免疫吸附試驗( ELISA) 或夾心酶聯免疫吸附試驗等結合。生物標誌物與酶標記的抗體特異性結合後，在特定的波長會產生光吸收，通過測試溶液吸光度變化來定量檢測膀胱癌標誌物濃度。該檢測方法具有設備簡單、操作快捷和快速檢測等優點。然而，這種方法檢測精度較低，雖然可以定性和半定量檢測分析物濃度，但是難以實現膀胱癌標誌物的精確定量。此外，這種方法在檢測膀胱癌生物標誌物方面還受限於靈敏度( 低於 60% ) 和特異性( 低於 80% ) 低的問題，因此膀胱癌診斷準確度較低。

基於熒光光譜的檢測手段

基於熒光光譜檢測膀胱癌生物標誌物主要是利用熒光發光光譜，檢測熒光染料標記的溶液發光強度或者樣品的熒光成像，以此來定性或者定量檢測生物標誌物。基於熒光光譜的分析方法有 ELISA、熒光原位雜交( FISH) 和熒光成像等。熒光光譜主要是 2000 年之後發展的檢測手段，至今仍有科研團隊開發出基於熒光光譜的新型檢測方法，並且此法也是醫學上最常用的檢測方法之一。

熒光光譜檢測膀胱癌生物標誌物具有操作簡單、檢出限低和重現性好的特點。然而，由於樣品前處理無法純凈的提取待測標誌物，造成檢測過程中非特異性干擾較大，或者熒光成像背景熒光干擾較大，降低了熒光光譜的精確度。因此，需要開發可以屏蔽背景熒光和減少非特異性結合的探針等來克服以上問題。最近，長餘輝發光材料得到了快速的發展，在激發停止後仍持續發出熒光，為膀胱癌細胞無背景熒光成像提供了一種可行性極強的策略。

基於電化學發光的檢測手段

電化學發光是利用電極原位產生試劑，這些試劑在溶液中反應，完成較高能量的電子轉移而生成激發態分子，不穩定的激發態分子回到基態過程中以光輻射形式釋放能量，檢測其發光光譜和強度從而達到對物質進行痕量分析的目的。

基於電化學發光檢測膀胱癌標誌物的方法是近幾年才發展的新興手段。這種方法檢測標誌物的線性範圍寬並且檢出限極低，可至 10 pg /mL。然而，這種方法的材料價格較為昂貴，並且一般不可重複檢測使用，所以還需要進一步探究可以重複使用且重現性好的電化學發光檢測手段。

基於電化學感測的檢測手段

電化學感測主要是利用生物物質與待測物質接觸時所產生的物理、化學變化，轉化為電訊號輸出以實現檢測。膀胱癌標誌物檢測中主要是構建電化學免疫感測器，由分子識別系統和電化學轉換器組合而成，分子識別系統是指固定的抗體或抗原，固定抗體或抗原在與對應的抗原或抗體結合時，電極的電化學性能會產生變化。

該檢測手段主要是利用比表面積高、生物相容性好和電化學性能優異的材料做基底，在其上修飾抗體，免疫結合生物標誌物後，電極的電學性能會產生微小變化，並且可以通過儀器精準地捕捉到該變化，以此來定量檢測生物標誌物濃度。這種方法是近幾年新發展起來的，也是發展最為迅速、最為優異的一種檢測手段，線性範圍比電化學發光更寬，檢測限更低，可低至 0. 33 pg /mL。但是同樣存在材料較為昂貴，且多數為一次性檢測器件的缺點，仍然需要進一步開發可循環使用且重現性良好的材料。

其它檢測手段

除了上述常用的幾種檢測手段，膀胱癌生物標誌物還可以用一些包括凝膠電泳、亞硫酸氫焦磷酸測序、免疫印跡試驗、拉曼光譜成像和核磁共振等檢測方法來進行定性和定量的檢測。

液體活檢的前景與挑戰

液體活檢是一種具有非常好的發展前景的膀胱癌生物標誌物檢測方法。相比膀胱鏡檢查和組織活檢的局部檢測，液體活檢是對尿液和血液的整體檢測，反映了腫瘤細胞的整體表達情況。液體活檢適用範圍較廣，可以對乳腺癌、結直腸癌、肺癌和胃癌等其它癌症進行診斷和監測。新一代測序技術和 ddPCＲ 技術的引入使循環腫瘤 DNA 檢測技術得到了改進，降低了操作成本，節省了檢測時間。

此外，與單一生物標誌物檢測相比，生物標誌物組檢測具有更高的靈敏度和特異性，從單一標誌物到多標誌物的轉變將有助於推動該領域向前發展，結合基因組學、轉錄組學和蛋白質組學以適應不同水平的標誌物檢測也有助於提高診斷準確性。電學感測具有較高的精確度，較低的檢出限和高的靈敏度，近幾年迅速發展的石墨烯、碳納米管和金屬複合氧化物材料等具有低成本、優異電導性能和良好生物兼容性，易於製備成高靈敏的檢測器件，加速膀胱癌數字化診斷的發展進程。

液體活檢以其非侵入性、可頻繁多次檢測和快速檢測等特點，在膀胱癌診斷中具有較好的發展潛力，但是還有許多生物、技術和臨床方面的挑戰需要解決。

在液體活檢前期樣品處理中，對尿液中沉澱物如蛋白質、ＲNA 和其它代謝物質的提取和分離還需要創新技術，以保證待測標誌物不缺失和變質。循環腫瘤分子應該反映腫瘤的整體情況，但並不是所有的腫瘤位點均相同，難以確定癌症是來自原發性腫瘤還是轉移性病變。

在膀胱癌早期，生物標誌物( 如 CK8 /18 等) 表達量與正常人的表達水平相當，難以確診是否患有膀胱癌。在膀胱癌生物標誌物方面，目前還沒有一種標誌物的特異性和靈敏度能達到 100% ，因此液體活檢目前還無法取代侵入性的膀胱鏡檢查。美國食品和藥物管理局審核批准的膀胱癌生物標誌物還需要進一步增多。

此外，液體活檢仍然缺乏大規模的臨床數據支持，目前沒有清晰的臨床共識。雖然液體活檢還存在很多問題需要克服，在未來的醫療行業中，液體活檢對腫瘤治療療效快速評價、腫瘤複發轉移風險監測、高危人群早期篩查和輔助診斷、新腫瘤藥物篩選、個體化治療方案選擇和腫瘤轉移機制的研究等方面均有著巨大的應用前景。

參 考 文 獻：

Ｒecent Advances of Liquid Biopsy for Bladder Cancer Diagnosing應 用 化 學第 36 卷 第 4 期

DOI: 10． 11944 /j． issn． 1000-0518． 2019． 04． 180412

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