抗磷脂抗體檢測的臨床應用專家共識
中國醫師協會風濕免疫科醫師分會自身抗體檢測專業委員會；國家風濕病數據中心；國家免疫疾病臨床醫學研究中心。抗磷脂抗體檢測的臨床應用專家共識。中華內科雜誌2019 年7月第58 卷第7期：496-500.
抗磷脂抗體（aPLs）是一組以磷脂和/或磷脂結合蛋白為靶抗原的自身抗體總稱。aPLs主要存在於抗磷脂綜合征（APS）等自身免疫病患者中，是APS最具特徵的實驗室指標。aPLs亦是血栓形成和病理妊娠的危險因素。同時，aPLs可見於惡性腫瘤、感染性疾病、某些藥物使用後，甚至部分健康人群中亦可出現[1]。其中狼瘡抗凝物（LA）、抗心磷脂抗體（aCL）、抗β2糖蛋白Ⅰ（β2GPⅠ）抗體作為APS分類標準中的實驗室指標[2]，目前臨床上廣泛應用，亦成為臨床實驗室最為常見的自身抗體檢測項目之一。aPLs檢測的標準化對其臨床應用至關重要，關於LA、aCL、抗β2GPⅠ抗體檢測的臨床應用標準化，已有不同國際學術組織發表的相關共識、指南[3-9]。
儘管已發表的國際共識、指南對規範aPLs的檢測及明確其臨床應用具有重要意義，但目前尚缺乏適合我國國情的aPLs檢測相關臨床應用共識，供臨床及實驗室遵循。中國醫師協會風濕免疫科醫師分會自身抗體檢測專業委員會於2017年9月組織國內臨床和實驗室專家召開關於相關自身抗體檢測臨床應用共識會,由8位臨床和實驗室專家依據國內外相關文獻，並結合國內實際情況及aPLs檢測應用臨床經驗，分別獨立起草共識草案，隨後對草案進行討論匯總形成共識初稿，經召開專家討論會由所有專家組成員逐條審議討論，達成一致意見後形成本共識，本共識的制定，旨在提高我國臨床醫務工作者對aPLs檢測的正確解讀、檢測等方面的認識水平，規範aPLs檢測，為臨床提供規範可靠的aPLs檢測結果報告。
一、aPLs分類
aPLs根據靶抗原的特性主要分為：（1）LA：一組能與負電荷磷脂和磷脂蛋白質複合物相結合的免疫球蛋白，主要基於LA在體外能延長磷脂依賴的不同途徑的凝血試驗時間來進行檢測；（2）抗負電荷磷脂抗體：aCL抗體、抗磷脂醯絲氨酸抗體、抗磷脂酸抗體、抗磷脂醯肌醇抗體等；（3）抗中性磷脂抗體：抗磷脂醯膽鹼抗體等；（4）抗兩性磷脂抗體：抗磷脂醯乙醇胺抗體等；（5）抗磷脂結合蛋白抗體：抗β2GPⅠ抗體、抗凝血酶原抗體、抗蛋白C抗體、抗蛋白S抗體、抗膜聯蛋白A2抗體、抗膜聯蛋白A5抗體等[10]。其中LA、aCL-IgG、aCL-IgM、抗β2GPⅠ-IgG、抗β2GPⅠ-IgM已作為國際血栓與止血學會(ISTH)2006年修訂的APS分類標準中的實驗室指標[2]。
但隨著新的生物標誌物不斷被研究發現，極大拓展了對aPLs的認識。許多新的aPLs已被證實可存在於臨床高度疑似的APS，但APS分類標準中LA、aCL-IgG、aCL-IgM、抗β2GPⅠ-IgG、抗β2GPⅠ-IgM陰性的患者，且這些新的aPLs可與患者血栓形成或病理妊娠等臨床表現具有一定的相關性[11-13]。如在中國APS患者新的aPLs研究顯示，抗磷脂醯絲氨酸-凝血酶原複合物抗體（aPS/PT）存在APS患者，特別是aCL和抗β2GPⅠ陰性的APS患者，與APS患者的血栓形成密切相關，亦與LA存在一定的相關性[14-15]。抗β2GPⅠ結構域Ⅰ-IgG陽性能增加APS患者的血栓形成風險，與抗β2GPⅠ-IgG顯著相關[16]。因此，這些新的aPLs有望成為APS分類標準中的實驗室指標。
二、aPLs檢測的臨床應用
1. APS篩查及診斷：aPLs作為APS特徵性的生物學標誌物，已成為APS分類標準中的實驗室指標。根據國際血栓與止血學會(ISTH)2006年修訂的APS分類標準，至少滿足1條臨床標準和一條實驗室標準方可診斷APS，見表1。
表12006年國際血栓與止血學會修訂的APS分類標準[2]
·臨床標準：
1.血栓形成：任何器官/組織發生的1次或1次以上動、靜脈或者小血管血栓形成（淺表靜脈血栓不作診斷指標）；必須有客觀證據（如影像學、組織病理學等）；組織病理學如有血栓形成，必須是血栓部位的血管壁無血管炎表現。
2.病理妊娠：
（1）1次或多次無法解釋的形態學正常的胎齡≥10周胎兒死亡，必須經超聲檢查或對胎兒直接體檢表明胎兒形態學正常；
（2）在妊娠34周前，因重度子癇或重度先兆子癇或嚴重胎盤功能不全所致1次或多次形態正常的新生兒早產；
（3）連續3次或3次以上無法解釋的胎齡﹤10周的自然流產，需除外母親生殖系統解剖異常，或激素水平異常，或因母親或父親染色體異常等因素所致；
·實驗室標準：
（1）狼瘡抗凝物陽性：需按照國際血栓與止血學會的指南在血漿中測得狼瘡抗凝物至少2次，每次間隔至少12周。
（2）採用標準化的ELISA法檢測血清或血漿中抗心磷脂抗體（aCL）：IgG/IgM型中高滴度陽性（IgG型aCL大於40GPL；IgM型aCL大於40MPL；或滴度大於99的百分位數）。
（3）採用標準化的ELISA法檢測血清或血漿抗β2糖蛋白Ⅰ抗體（抗β2GPⅠ）：IgG/IgM型陽性（滴度大於99的百分位數）。
註：上述檢測均要求間隔12周以上，至少2次或2次以上陽性，如果aPLs結果陽性與臨床表現之間間隔<12周，或間隔超過5年，則不能診斷。
隨著對aPLs的認識不斷深入，aPLs與多種分類標準外臨床的表現有密切關聯，包括血小板減少症、溶血性貧血、腎臟病變（如血栓性微血管病相關腎病、惡性高血壓）、心臟瓣膜病變、皮膚病變（如網狀青斑、皮膚潰瘍）、神經系統病變（偏頭痛、舞蹈症、癲癇、原因未明的認知功能障礙）等。
綜上，臨床上建議檢測aPLs的群體不僅限於動脈或靜脈血栓事件患者、病理妊娠患者，還應包括出現上述APS分類標準外的臨床表現的患者。
2.血栓及病理妊娠的風險評估：
LA、aCL及抗β2GPⅠ抗體的聯合檢測不僅用於APS的診斷，還有助於APS患者血栓事件再發風險分層。與aCL、抗β2GPⅠ抗體比，LA陽性與血栓、病理妊娠等臨床事件有更強的相關性[[i]]。與aCL-IgM、抗β2GPⅠ-IgM比，aCL-IgG、抗β2GPⅠ-IgG陽性與發生的臨床事件相關性更大。LA、aCL、抗β2GPⅠ抗體同時陽性（即3種抗體陽性），與1種或2種自身抗體陽性比，血栓形成或病理妊娠的發生幾率更高。aCL、抗β2GPⅠ抗體的IgG、IgM亞型，陽性檢測值高低與臨床事件的相關性尚不明確。
血栓風險評估：國外已有研究提示，GAPSS（國際APS評分）評分系統[包括高血壓 1分，高脂血症 3分，LA 4分，aCL-IgG/IgM5分，抗β2GPⅠ-IgG/IgM4分，抗磷脂醯絲氨酸-凝血酶原複合物抗體（aPS/PT） 3分]能有效預測SLE和APS患者血栓再發風險；GAPSS 10分為血栓再發高危人群。
病理妊娠風險評估：LA、aCL、抗β2GPⅠ抗體同時陽性（即3種抗體陽性），既往明確病理妊娠史，以及合併SLE等其他結締組織病是APS患者發生病理妊娠的高危因素。
三、aPLs檢測
（一）LA
LA的檢測方法包括：（1）篩查試驗：包括稀釋的蝰蛇毒磷脂時間法（dRVVT）、活化部分凝血活酶時間法（APTT）、硅凝固時間法（SCT）、大斑蛇凝血時間法（TSVT）及蛇靜脈酶時間法（ET）等[21]。目前，ISTH、臨床實驗室標準化協會（CLSI）等國際指南[3,22]推薦對LA採用2種不同凝血途徑的方法進行檢測，其中dRVVT和APTT是國際上最常用的檢測方法，通常dRVVT作為第一種選擇的方法，敏感性較好的APTT（低磷脂或二氧化硅作為活化劑）作為第二種方法。（2）混合試驗：將患者血漿與正常血漿（1:1）進行混合，以證實凝血時間延長並不是由於凝血因子缺乏導致。（3）確證試驗：採用改變磷脂的濃度或組成來確證LA的存在。LA的相關檢測流程，見圖1。但在臨床實踐中，會出現混合試驗由於加入正常血漿後引起的稀釋作用，從而導致本來弱陽性的LA出現假陰性檢測結果，另外亦會由於其他原因引起混合試驗的假陰性。因此CLSI[22]提出，對於LA的檢測程序為篩查試驗-確證試驗-混合試驗，當篩查試驗和確證試驗檢測結果難以解釋時再進行混合試驗。同樣第14屆抗磷脂抗體國際會議上亦提出[13]，LA的檢測程序為篩查試驗-確證試驗，當篩查試驗或確證試驗陰性時，如臨床疑似APS時，需進行混合試驗。
LA的檢測應在抗凝藥物治療前或抗凝藥物停用足夠時間（至少1周）後採集血液標本。使用0.109mmol/L檸檬酸鈉進行抗凝，抗凝劑與血液的比例為1：9。血液標本採集後應及時進行離心（推薦2次離心，），以確保離心後血漿中的血小板計數小於10x109/L，確保凝血因子活性。不建議採用過濾法分離獲得血漿。若不能及時檢測，離心後的血漿標本需-70℃或更低溫度保存，檢測前使用37℃水浴復溶血漿標本，並充分混勻。LA混合試驗（循環抗凝指數）和確證試驗（糾正百分比、標準化比值）的檢測結果建議採用待測患者血漿與正常血漿的比值來表示，LA檢測結果除上述比值以外，還應有陰性、陽性的結果判斷。建議使用非參數的百分位數方法建立臨界（cut off）值，推薦採用99的百分位數（99%），大於臨界值判斷為陽性[3]。
註：該檢測程序適用於未服用抗凝劑的患者；加入磷脂後凝固時間顯著縮短，通常定義為加入磷脂前的凝固時間/加入磷脂後的凝固時間的比值大於1.3[1]；dRVVT：稀釋的蝰蛇毒磷脂時間法；APTT：活化部分凝血活酶時間法
（二）aCL抗體、抗β2GPⅠ抗體[4]
1.標本要求：建議使用血清標本，避免熱滅活、溶血及脂血標本。血清標本2~8℃可保存2~3d，-20℃及以下溫度能更長時間保存，避免反覆凍融。
2.aCL抗體、抗β2GPⅠ抗體的不同亞型：建議檢測aCL-IgG和aCL-IgM抗體、抗β2GPⅠ-IgG和抗β2GPⅠ-IgM抗體，若aCL、抗β2GPⅠ抗體的IgG和IgM亞型陰性，但臨床疑似APS時，建議檢測aCL、抗β2GPⅠ抗體的IgA亞型。
3.靶抗原：aCL抗體檢測的靶抗原應包括心磷脂和β2GPⅠ，抗β2GPⅠ抗體檢測的靶抗原應採用包括全部氨基酸序列區域（結構域Ⅰ~Ⅴ）的人源性β2GPⅠ。
4.檢測方法：ELISA作為aCL、aβ2GPⅠ抗體的常規檢測方法，目前在臨床上廣泛應用。但ELISA方法存在標準化的缺乏、實驗操作的影響因素較多、實驗室間檢測結果的變異係數大等缺陷[23]。而化學發光法（CLIA）檢測aCL、抗β2GPⅠ抗體與ELISA比，具有較高的敏感性和特異性，能實現實驗操作簡單、快速、自動化、急診模式進樣、定量檢測及變異係數小等[24-26]。
另外，近年來美國病理家學會（CAP）關於aCL、抗β2GPⅠ抗體檢測室間質評結果顯示，其檢測方法已從最初的僅使用ELISA發展到CLIA、熒光酶免疫法（FEIA）和懸浮微陣列技術（xMAP）等。因此，化學發光法、熒光酶免疫法、懸浮微陣列技術等自動化、定量檢測方法是aCL、抗β2GPⅠ抗體今後發展的必然趨勢，且會逐漸應用於國內的臨床實驗室。
4.檢測結果單位：aCL-IgG、aCL-IgM檢測單位建議使用GPL、MPL（即1個GPL、MPL單位分別為1ug/ml純化的IgG、IgM型aCL結合抗原的活性）。抗β2GPⅠ抗體檢測結果的國際單位正在進行有效性研究。使用國際單位可促進檢測結果在不同實驗室、方法學間的一致性和可比性。
5.定標：建議使用多點定標，定標值與其預計值的相關係數應大於或等於0.90。
6.精密度：建議免疫學方法檢測aCL、抗β2GPⅠ抗體的變異係數（CV）應小於或等於10%，CV值20%是最大可接受值。精密度評估應包括檢測範圍的多個水平值（包括臨界值）。對廠家提供的檢測試劑，應在說明書中明確預期達到的精密度。
7.室內質控：每批次檢測時，建議使用陰性和陽性質控物進行質控，推薦使用外部質控物，陽性質控至少要包括檢測值接近臨界（cut off）值的質控物。若陰性或陽性質控物的檢測結果超過既定的檢測範圍，如陰性質控檢測為陽性，或陽性質控檢測為陰性，則應拒絕該批次實驗。
8.參考值：（1）定性檢測：建議使用非參數的百分位數方法建立臨界（cut off）值，推薦採用99的百分位數（99%），大於臨界（cut off）值判斷為陽性；（2）定量檢測：可參照CLSI EP28-a3c的要求，募集至少120例表觀健康人群的血漿標本建立參考區間，臨床實驗室可採用20~60例表觀健康人群驗證該參考區間。
9.檢測結果報告：建議aCL、抗β2GPⅠ抗體的檢測結果報告中應包括檢測方法、檢測結果及單位。aCL、抗β2GPⅠ抗體的中高滴度檢測結果通常為99的百分位數（99%）的2倍以上。
四、aPLs檢測結果的臨床解讀[1,13]
1.APLs陽性不僅是APS的診斷標準之一，aPLs陽性亦可出現在SLE等自身免疫病、惡性腫瘤（如淋巴瘤、白血病、肺癌等）、感染性疾病（如梅毒、結核、傳染性單核細胞增多症等）、某些藥物（如普魯卡因醯胺、氯丙嗪、避孕藥等）使用後及部分健康人群中。
2.接受華法林、肝素及新型口服抗凝劑治療的患者可能出現LA假陽性，因此對接受抗凝劑治療患者的LA檢測結果，應謹慎解讀。由於當前LA檢測缺乏標準化，若檢測結果與臨床不符時，應進行實驗室與臨床的相互溝通，以明確其確切意義。
3.aCL、抗β2GPⅠ抗體檢測通常包括IgG、IgM、IgA亞型。aCL-IgA、抗β2GPⅠ-IgA目前尚未納入APS分類標準，單獨aCL-IgA、抗β2GPⅠ-IgA中高滴度陽性臨床上較少出現，確切的臨床意義仍有待深入研究。
4.aPLs低滴度陽性可見於生理性、暫時性、感染或病理狀態。儘管APS分類標準中要求APLs持續中高滴度陽性，但低滴度aPLs亦可能有臨床意義（特別是病理妊娠），需密切結合臨床表現加以判斷，必要時重複檢測。另外，由於不同aPLs檢測方法學間的差異，檢測結果數值不具可比性。因此，在目前aPLs檢測時缺乏參考物質、參考方法等情況下，對aPLs低滴度陽性需結合患者臨床表現，並定期檢測隨訪。
5.新型aPLs檢測項目：雖然LA、aCL-IgG、aCL-IgM、抗β2GPⅠ-IgG、抗β2GPⅠ-IgM抗體檢測是APS分類標準中的實驗室指標，但其他新型APLs檢測項目（如aPS/PT、aCL-IgA、抗β2GPⅠ-IgA、抗β2GPⅠ結構域Ⅰ抗體等）的相關臨床意義，仍有待在長期、前瞻性的研究及臨床實踐中深入探討。
TAG:顧建文教授醫學科普 |