宏基因組測序在精準防控傳染病中的應用

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宏基因組學研究廣泛應用於土壤、水體等環境樣本，以及與人類疾病相關的微生物群落的生物多樣性分析。此外，由於宏基因組學無需單獨對病原分離培養，通過核酸提取純化可以直接分析臨床樣本，其為傳染病病原尤其是未知病原檢測提供了新的技術手段和思路。

基於宏基因組學的二代測序(mNGS)可以得到樣本中全部物種的基因組，從而能同時識別所有致病病原體，極大減少逐個排除可疑病原所耗費的時間及人力物力，並可對未知病原或已知變異較大病原進行識別，為傳染病防控帶來新的思路。目前，mNGS在公共衛生監測、病原檢測以及傳染病溯源等方面得到了廣泛應用。

病原監測

採集某一地區或人群的臨床樣本、食品和媒介生物等各類樣本進行宏基因組學測序，監測潛在致病病原，對可能出現的疫情進行預測預警，可有效預防突發公共衛生事件的發生。宏基因組測序能夠克服傳統方法的局限性，實現病原的高精度識別，為日常病原監測提供指導。

在一項研究中，研究者收集了24例季節性流感患者支氣管肺泡灌洗液、痰液和咽拭子樣本，實時定量PCR結果顯示H3N2 和H1N1呈陽性，但不能進一步分型， 通過宏基因組測序並與已報道的基因組比對，能精確其具體型別，而且在部分樣本中發現其它病毒或細菌的混合感染。

隨著全球化貿易的發展，病原藉助於食品進行傳播的風險加大，食品監測日益重要，但受限於檢測範圍，不能完全排除食物攜帶病原的可能性。研究者們通過對進口動物肉製品進行宏基因組測序，檢測到冠狀病毒、黃病毒、痘病毒、漢坦病毒等可能感染人類的病毒，表明其可能存在致病風險。

相同策略的宏基因組研究方法也可監測媒介生物，評估病原體感染人類的可能性，預防人畜共患病發生。為評估野生老鼠攜帶病毒對人類的致病風險，研究者採集了德國柏林地區 20隻野生老鼠的腸道提取物樣本並進行測序，檢測到博卡病毒、沙波病毒、諾瓦克病毒和輪狀病毒等多種病原，其中的輪狀病毒株與人類致病密切相關。

病原檢測

不明原因疾病和未知病原增加了臨床診斷難度，無法進行有效治療，導致患者病情加重甚至死亡。基於宏基因組學的測序在病原檢測中發揮日益重要的作用。

幾年前，德國暴發了急性腸出血性流行病，疫情初期沒有特異性手段檢測病原感染，而分離培養耗時長且比較困難。在對此次疫情進行回顧性研究中， 研究人員採用宏基因組檢測方法，採取40例疫情暴發期間的產志賀毒素型大腸桿菌（STEC）陽性糞便樣本，並使用5例STEC陰性腹瀉樣本作為對照，未經分離培養直接提取DNA進行測序。在STEC陽性患者的樣本中檢測到該疾病的致病菌株 STEC O104∶H4，並且進一步檢測到產志賀毒素的基因片段，在5例對照組中也檢測到了艱難梭菌、空腸彎曲桿菌和沙門氏菌的感染。這表明了宏基因組使用非培養樣本檢測病原體並分析其毒力的潛力。

2016年４月在安哥拉暴發了大規模的黃熱病疫情。所報告的感染病例超過1700例，另外更有238例死亡病例。

黃熱病此前從未在東亞或中國見諸報道。而在2016年3月，中國出現了首例輸入性的黃熱病。患者為在安哥拉務工並返回中國的中國籍勞務輸入人員。

藉助宏基因組測序技術，該病例血液樣本在24小時內完成了全基因組測序工作，將相關測序讀長進行組裝和拼接，得到的一致性序列進行BLAST比對，結果與Angola71型毒株親緣關係最近。隨後的定量PCR回溯驗證了測序結果。

病原溯源

在調查傳染病疫情時，宏基因組學在對樣本進行測序後，還可以對病原進行追溯，找到潛在傳播途徑，及時確定和切斷感染源。

寨卡病毒通過蚊蟲叮咬傳播，孕婦感染後可導致新生兒小頭症，2016 年寨卡病毒疫情暴發引起了廣泛的關注。

研究者通過對兩例孕婦患者的羊水樣本直接進行高通量測序，檢測到寨卡病毒的全基因組，表明寨卡病毒可以穿過胎盤屏障感染胎兒，隨後利用PCR和ELISA驗證檢測結果，進一步全基因組系統發育分析顯示其與法屬波利尼西亞的寨卡病毒具有97-100%的相似度，這為建立寨卡病毒和小頭症的聯繫及確定病毒來源提供了重要參考。

此外，研究人員發展了直接對臨床樣本測序的方法，通過多重PCR富集病毒基因組，並進行測序分析，可以得到病毒全部序列。基於上述方法，另一組研究團隊獲得感染患者的寨卡病毒序列，通過比對及溯源分析，發現該序列和北美地區埃及伊蚊中的病毒序列相似，推測病毒從瓜地馬拉傳入，並可能繼續向北擴散，這為防止寨卡病毒進一步傳播提供指導。據世界衛生組織報告，2017年和2018年寨卡病毒的發病率大幅下降。

利用宏基因組方法還可以對一些歷史疫情或病例進行研究，從而對傳染病病原進行時空溯源。一項研究收集了來自英國、丹麥、瑞典的距今1010-1383年共計22例骨骼和牙齒樣本，使用宏基因組測序方法檢測到麻風桿菌，並通過分析不同地區麻風桿菌的序列差異，探究麻風桿菌的起源與演變，推測美洲麻風病可能來源於歐洲，並且中東地區麻風桿菌基因型與中世紀歐洲地區基因型相關。

另外，在對一名1797年的木乃伊肺部殘留組織樣本提取核酸後進行測序後，發現其受到分布在歐洲和北美地區的兩種不同基因型結核分枝桿菌的混合感染，這對研究結核分枝桿菌在世界範圍內傳播的過程具有重要意義。

高效控制新發傳染病

張文宏團隊利用宏基因組學方法，首次鑒定並治癒了豬皰疹病毒跨物種傳播所致人類感染。這一成果源於華山醫院感染科的一例病例。

2017年6月，華山醫院感染科接診了一名發熱待查患者。追問病史，患者平日在養豬場工作，發病前一日被豬圈中的污水潑濺入雙眼。考慮到人豬共患病所致中樞神經感染及眼內炎的可能，華山醫院感染科送檢術眼玻璃體液及腦脊液進行基於宏基因組學的二代測序 (mNGS)，以明確病原學診斷。

報告顯示：患者腦脊液中未測得病原體，術眼玻璃體液中測出4832條豬皰疹病毒序列，覆蓋度高達84%。但對於豬皰疹病毒這一以豬為自然宿主的病毒，在人類中隨曾有疑似病例報道，但從無確診病例。

結合患者的豬圈污染物接觸史、眼內炎的臨床表現及眼內手術標本測序結果，臨床團隊高度懷疑豬皰疹病毒感染，當即給予患者抗病毒治療。

華山感染團隊迅速分成三個團隊分工合作。隨後從基因學水平和免疫學水平同時鑒定豬皰疹病毒跨物種感染人病例的存在。多方證據協助臨床確診患者豬皰疹病毒感染，同時患者經過強化精準治療獲得病情緩解。

基於宏基因組學的二代測序 (mNGS)的不斷發展， 運用宏基因組學技術進行病原監測、檢測和溯源，能夠精準應對新突發傳染病疫情，為公共衛生和疾病精準防控領域開闢了一條光明的通道。

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