胃幹細胞研究現狀與進展

摘要

胃幹細胞在胃黏膜上皮動態更新和損傷修復中發揮關鍵作用。近年來，對胃幹細胞分子標誌物的研究取得較大進展，體外胃幹細胞研究模型也成功建立，這為深入探究胃幹細胞在胃黏膜病變(如H.pylori感染、胃癌)中的作用機制奠定了基礎。基於胃幹細胞和胃幹細胞池微環境探究其潛在的病理生理意義具有重要價值。

幹細胞是一類具有自我更新能力、高度增殖能力和多種分化潛能的細胞，根據其來源不同可分為胚胎幹細胞和成體幹細胞。其中，成體幹細胞是指存在於人體組織中具有自我更新和多向分化潛能的細胞，其對於組織更新與損傷修復至關重要。胃幹細胞即為存在於胃組織中的成體幹細胞，在維持胃黏膜上皮動態更新中發揮關鍵作。隨著研究的不斷深入和研究技術的革新，對胃幹細胞分子標誌物及細胞調控的探索取得了較大進展，體外胃幹細胞研究模型的建立為進一步揭示胃幹細胞在胃部生理及病理狀態下的意義提供了條件。基於實體腫瘤可能是幹細胞疾病的理論，已有研究闡明胃癌的發生亦與胃幹細胞關係密切，這為胃癌的防治提供了新的方向和契機。本研究立足於胃幹細胞的生理特點、體外研究模型及其在胃部疾病(H.pylori感染和胃癌)中作用等角度，對胃幹細胞的研究現狀與進展作一綜述。

一

胃幹細胞的定位、分子標誌物和分化調控

胃小凹及其相連的3～5個胃腺體構成的胃單元(gastric unit)是胃黏膜的基本結構單位，胃腺體由淺入深可分為峽部、頸部和底部，峽部開口於胃小凹。在生理狀態下，胃黏膜處於持續動態更新中，胃腺體峽部和頸部的細胞處於活躍增殖的狀態，該區域被視為胃幹細胞所在的位置，但在早年的研究中並未得到直接的證據。隨著細胞譜系分化示蹤技術的出現和發展，大量的研究已證實胃腺體的頸部-峽部區域及不同解剖部位的胃腺體基底部為胃幹細胞所在的位置，其周圍的細胞和細胞外基質成分則形成了幹細胞池特定的微環境[]。在微環境中生長因子作用下，不同部位的胃幹細胞可向頸黏液細胞、主細胞、壁細胞和內分泌細胞等定向分化，最終形成成熟的胃黏膜上皮。在正常的生理狀態下，這一動態更新過程約2～7 d發生一次；而在損傷、感染等情況下，隨著上皮更新加速，胃幹細胞分化進程也顯著加快。

目前已發現的胃幹細胞的常見分子標誌物有富含亮氨酸重複序列的G蛋白耦聯受體5(leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5，Lgr5)，三葉因子家族2(trefoil factor family 2，TFF2)，性別決定域Y框蛋白2 (sex determining region Y box protein 2，SOX2)，膽囊收縮素B型受體(cholecystokinin type-B receptor，CCK2R)，肌肉、小腸和胃表達因子1(muscle, intestine and stomach expression 1，Mist1)，多亮氨酸重複區免疫球蛋白樣蛋白1(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domain 1，Lrig1)，絨毛蛋白(Villin)啟動子，以及由腫瘤壞死因子受體超家族成員19(tumor necrosis factor receptor superfamily 19, TNFRSF19)編碼的蛋白質Troy等(表1)。Barker等通過體內譜系示蹤實驗證實，胃竇幽門腺體底部Lgr5陽性表達的細胞為具有自我更新和多向分化潛能的幹細胞，其可作為胃幹細胞的識別標誌物。TFF2多由位於胃底腺峽部的幹細胞表達，可分化形成上皮祖細胞，後雙向分化形成頸黏液細胞、壁細胞和主細胞。Arnold等應用Sox2-CreER；ROSA26-lsl-EYFP轉基因小鼠模型進行譜系示蹤發現在胃幽門區的腺體中存在一小部分SOX2陽性的細胞，這些細胞具有自我更新和產生成熟的胃腺細胞的能力。隨著研究的深入，胃竇部CCK2R標記陽性的細胞也被證實是胃幹細胞，其可對促胃液素髮生應答，該類細胞與胃竇部腺體底部Lgr5 的胃幹細胞並不相同。Mist1作為胃腸道外分泌細胞中分泌顆粒形成和成熟的必需因子，相關研究亦證實其可作為胃體腺峽部靜止期幹細胞的表面標誌物。Lrig1可作為胃體祖細胞的分子標誌物，陽性細胞最終可定向分化形成胃體細胞。Villin啟動子標記陽性的胃祖細胞主要位於幽門腺峽部下1/3的部分腺體，在胃體腺幾乎無此類幹細胞，譜系示蹤顯示該類細胞可向黏液腺細胞、內分泌細胞和壁細胞分化，並且可參與γ-干擾素誘導的炎症應答，此類細胞的表型轉化與胃黏膜腸化生無關。胃體部Troy 的部分主細胞亦被認為是胃體幹細胞的標誌分子，可分化形成所有胃上皮細胞類型並參與毒素所致的黏膜損傷修復。上述研究亦表明不同解剖部位的胃黏膜腺體幹細胞在其起源、增殖、分化和表達譜上存在差異。

表1胃幹細胞/祖細胞分子標誌物、細胞定位及分化方向

胃幹細胞的增殖、生長和分化的調控與幹細胞池內特定微環境密切相關，這一微環境主要由一組細胞和胞外基質組成。其中，腸上皮下成纖維肌細胞在促進胃幹細胞向其成熟的子細胞分化的啟動環節中發揮關鍵作用，腸上皮下成纖維肌細胞分泌產生的肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、TGF-β等生長因子與幹細胞表面的受體結合，從而啟動分化。另外，Wnt/β-聯蛋白(β-catenin)、Notch、Hedgehog等信號通路在胃幹細胞的自我更新、增殖和凋亡的調控中也發揮了重要作用，任何一個信號通路的調控發生異常都有可能誘發其惡性轉化。例如，Oshima等在K19-Wnt1轉基因模型小鼠中證實Wnt信號通路對於維持胃體峽部區域祖細胞的未分化狀態至關重要，該信號的異常持續激活可使祖細胞數目顯著增多。也有研究指出Notch可直接調控Lgr5 胃幹細胞，其異常激活可促使胃幹細胞向胃癌幹細胞轉化而導致胃癌發生。

二

胃幹細胞體外研究模型

2007年，Yang等首次通過一種新的體外細胞培養方法從健康的人胃組織里培養出胃上皮細胞克隆，這些細胞克隆具有近似胃幹細胞的特性，包括快速增殖、多向分化、八聚體結合轉錄因子4(octamer transcription factor 4, Oct-4)陽性表達等。隨後，Barker等將Lgr5-EGFP-ires-CreERT2小鼠胃腺體內分離出的單個Lgr5 ve細胞培養在含有EGF、Noggin、R-sponding的三維基質膠(matrigel)培養體系中，發現在該培養體系下Lgr5 ve細胞能夠形成類似於胃的微型結構，即胃類器官(gastric organoid)。該液體環境模擬體內幹細胞所處的微環境，R-spondin(Wnt信號通路激活劑)和EGF是維持Lgr5 胃幹細胞體外增殖的重要因素，Noggin可促使類器官中胃小凹數目增多，富含層黏連蛋白的基質膠提供支持胃類器官生長的環境。這一胃類器官模型在體外可以進行長期增殖並保持穩定的遺傳特性和生物學行為，同時因其包含了能夠產生多種細胞亞型的祖細胞群，其在體外培養誘導條件下能夠分化形成具有不同功能的胃上皮細胞。2017年，Garcia等使用富含EGF、HGF、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)等的培養基對成人胃黏膜層細胞進行原代分離培養，觀察到在呈單層生長的胃成纖維細胞表面可見球狀克隆形成，對成球狀生長的細胞團進一步鑒定發現這些細胞可表達胚胎幹細胞和胃幹細胞特有的分子標誌物，並能在體外培養條件下自發分化形成胃上皮祖細胞。上述體外胃幹細胞模型的成功建立，尤其是胃類器官模型的建立，為進一步深入探究胃幹細胞在生理和病理條件下的作用機制奠定了基礎。

三

H.pylori感染與胃幹細胞

H．pylori長期持續感染是致胃癌發生的關鍵誘因之一，基本機制包括長期感染後胃黏膜慢性炎症刺激、腫瘤抑癌基因的遺傳學和表觀遺傳學的改變、致癌信號通路的激活等。除上述作用機制外，近來相關研究表明H.pylori感染亦能誘發胃幹細胞靜息-增殖分化失衡，促使胃幹細胞表型轉化而參與其致癌過程。既往研究認為H.pylori主要定植於胃黏膜表面的細胞，通過細菌所具有的Ⅳ型分泌系統將致病因子細胞毒素相關蛋白A(cytotoxin associated gene A, CagA)導入細胞內而致病。近年研究發現，在H.pylori感染後的小鼠及人的胃黏膜標本中，胃腺體的頸部和腺體基底部的胃幹細胞池亦可觀察到H.pylori定植形成的微菌落，說明H.pylori可以直接作用於胃幹細胞而參與致病。應用Lgr5-Egfp-ires-cREert2/Rosa26-TdTomato小鼠感染H.pylori模型研究證實，定植於胃幹細胞池內的H.pylori在胃黏膜尚未出現顯著的炎症表現時即可通過直接作用於Lgr5 胃幹細胞加速其增殖分化，且該促進作用依賴於H.pylori的CagA毒力因子。Sigal等研究發現H.pylori除直接作用於胃幹細胞外，還可促進胃黏膜下方的間質成纖維細胞合成分泌R-spondin增多，R-spondin可激活Wnt信號通路，誘導位於腺體基底部的Axin2 /Lgr5-胃幹細胞過度增殖，致使幹細胞在增殖過程中累積大量DNA損傷，從而誘發癌症。與H.pylori陰性的胃癌患者相比，H.pylori陽性的胃癌患者胃竇黏膜Lgr5 細胞數顯著增多，並且Lgr5 細胞比Lgr5-細胞DNA氧化損傷水平更高，提示H.pylori可通過介導胃幹細胞的DNA損傷增加胃癌發生風險。H.pylori持續感染還可激活Notch、Hedgehog等信號通路，誘發乾細胞池微環境紊亂，促進胃幹細胞增殖、分化失衡甚至惡性轉化。此外，胃幹細胞在H.pylori感染引發的持續炎性反應作用下，腸型或胃型上皮相關基因激活導致的表型轉化亦參與了H.pylori致癌的病理過程。

四

胃幹細胞與胃癌的發生

胃癌的發生是一多步驟、多階段的過程，其與宿主因素、環境因素等密切相關。根據胃癌的組織學形態和細胞特點將胃癌分為腸型、瀰漫型和混合型(即Lauren分型)。腸型胃癌發生的Correa模型認為胃黏膜經歷慢性炎症反應、萎縮、腸化生甚至異型增生，最終形成腸型胃癌，該理論已得到廣泛的認同。瀰漫型胃癌的發生模式不同於腸型胃癌。既往針對瀰漫型胃癌的病理組織標本研究發現，家族性早期瀰漫型胃癌在結構上呈現"雙層結構"：上層的印戒細胞體積較大，黏液豐富，多處於靜止狀態；而基底層的印戒細胞較原始，體積較小，增殖活躍，並在空間位置上靠近癌旁的胃腺頸部/峽部的增殖區，這一區域恰恰被認為是胃幹細胞所在的區域，這從腫瘤發生的空間位置上提示瀰漫型胃癌可能起源於胃幹細胞。此外，瀰漫型胃癌組織內包含了多種不同分化類型的癌細胞，其中大部分癌細胞在分化上與胃小凹上皮相似，部分癌細胞類似於幽門上皮，同時尚有部分癌細胞可表現出神經內分泌細胞的特點。瀰漫型胃癌所具有的這一多向性分化特點提示其組織學的發生可能來源於具有多向分化潛能的胃幹細胞，但目前尚未有相關研究證實。Tatematsu等發現，胃幹細胞在腸上皮分化過程中表現出異常的細胞分化，同一個幹細胞可產生胃、腸型細胞，不同組織類型胃癌的表型表達也被相應地分為胃型和腸型細胞。此外，Kirchner等認為，胃癌起源於胃幹細胞，這些幹細胞從胚胎髮育開始保持在未分化狀態，或是源於成熟細胞的去分化而使其重新成為具有增生和更新潛能的細胞。

動物體內實驗進一步表明胃幹細胞確實對胃癌起源具有重要意義。Li等研究表明，Lgr5 胃幹細胞在Smad4和10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN)敲除小鼠的胃竇部可迅速從微腺瘤發展成浸潤性腺癌，而胃竇部分化成熟的Lgr5 壁細胞、小凹細胞及體部的主細胞並未形成腫瘤，進一步針對腫瘤基因組計劃(The Cancer Genome Atlas，TCGA)資料庫內數據分析的結果亦支持胃竇部和胃食管交界處的腸型腺癌均伴有Lgr5的擴增。雖然胃竇部Lgr5 胃幹細胞可分化形成胃黏膜上皮的所有細胞類型包括內分泌細胞，但Vetter等通過對CEA424-SV40-Tag轉基因小鼠的研究發現，幽門部Lgr5 胃幹細胞並非胃神經內分泌腫瘤的起源細胞。也有研究證實Lgr5 細胞並非解痙多肽表達性化生(spasmolytic polypeptide-expressing metaplasia，SPEM)的起源細胞。Sarkar等在Apc缺失的小鼠體內研究發現，SOX2的表達缺失上調Tcf/Lef依賴的轉錄及腸化生相關基因的表達，最終可導致腫瘤的形成，這提示SOX2除作為胃幹細胞的標誌物外，還可能作為一種抑癌蛋白，經由Wnt通路在胃腫瘤發生中發揮抑制作用。此外，轉錄因子Klf-4的表達下調與胃癌發生有關。在Klf-4敲除小鼠體內研究發現，Villin啟動子表達陽性的胃竇小彎腺體底部的幹細胞增殖加快，並且該區域胃黏膜出現黏膜增生及自發性胃腺瘤的形成，但這部分胃腺瘤即使在化學致癌劑亞硝基甲基脲作用下也不向腺癌進展，提示還存在其他分子機制參與Klf-4表達缺失的Villin啟動子陽性幹細胞向腫瘤幹細胞的轉化。另外，胃腸道上皮的更新極為迅速，因此上皮細胞的突變一般不足以引發惡性病變，這提示壽命較長的幹細胞更易在外界環境如炎症持續刺激、致癌物刺激等作用下累積突變而發生惡性轉化，從而誘發胃癌形成。

五

小結和展望

胃幹細胞在胃黏膜上皮的動態更新和損傷後修復中發揮關鍵作用。隨著譜系追蹤和分子標記等技術的發展，人們對於胃幹細胞的生理特性的認識取得突破性進展，也確定了Lgr5、SOX2等分子標誌物，並建立了體外研究模型。由於胃幹細胞增殖、分化的動態平衡是維持幹細胞池穩態的關鍵，持續的炎症反應可誘發乾細胞增殖加速而致胃幹細胞池失穩態，進而參與胃黏膜病變的發生。H.pylori感染誘發胃幹細胞靜息-增殖分化失衡及細胞表型轉化可能是其致胃癌的機制之一。同時，胃幹細胞也可能作為胃腫瘤的起源細胞而參與了胃癌發生、發展的多個步驟。深入探究胃幹細胞在胃黏膜損傷修復中的作用機制及其在胃黏膜發生腸化生和異型增生中的作用至關重要，尤其是如何將胃幹細胞與H.pylori的致病機制、胃癌發生的分子機制及起源之間聯繫起來可能成為今後研究熱點。隨著幹細胞研究技術及理論的發展和深入，胃幹細胞的研究在胃部疾病防治方面具有廣闊前景。

參考文獻（略）

作者：肖士渝 周麗雅 來源：消化科空間

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