高通量測序鑒定花生B02染色體上抗青枯病的基因組區域及診斷標記的開發

栽培花生(Arachis hypogaea L.)，又稱為花生，是一種重要的豆科植物，全球花生產量超過4398萬噸，其果實可用作食用堅果、做食用油、花生醬、糖果等。中國和印度是兩大花生生產國。

花生中最主要的一種病害是青枯病，是由青枯雷爾氏菌引起的。該病原菌通常感染植物的根部，然後通過維管束傳到地上部分。如果這些細菌繁殖到一定程度，植物就會出現萎蔫癥狀甚至死亡。青枯病是花生生產國中的毀滅性病害，在我國13個主要花生生產省份中已被發現，並可能造成高達50-100%的產量損失。通過選育具有穩定抗性的花生品種是防治青枯病最有效的途徑。通過常規育種培育了幾十個抗病品種，並廣泛用於花生生產。它們的抗性在植物中是最穩定和最持久的。

關於花生抗青枯病的遺傳機制目前了解得很少，通過了解控制性狀的遺傳機制，找到候選基因，可以開發分子標記，用於基因組輔助育種，將極大地縮短育種時間，培育抗病品種。由於栽培花生(AABB，2n=4x=40)的A、B亞基因組具有很高的相似性，花生基因組大(~2.7Gb)，分子標記多態性低，因此用傳統分子標記覆蓋整個基因組具有挑戰性大、耗時和勞動強度大等特點。因此需要更有效的策略快速定位抗青枯病的QTL，通過基因組輔助育種(GAB)，加快培育優良品種進程。

QTL-seq是一種結合了BSA及高通量測序的方法，能夠快速進行QTL定位。該方法只需要對2個親本及2個子代混池進行測序，具有高效、成本低的特點，已在豌豆、花生、鷹嘴豆等多種物種上得以應用。本研究使用QTL-seq方法對花生青枯病抗性進行了研究。

材 料

由抗病親本Yuanza9102(RP)與感病親本Xuzhou68-4(SP)構建的RIL群體(含195個個體)。用收穫前的存活率評估其抗性。從中選取15個最低存活率的植株(2.15-11.54%)構建感病混池SB；選取存活率最高的15個(92.96%-100%)構建抗病混池。

測 序

對2個親本及2個混池的DNA分別構建了~350bp文庫，採用Illumina NovaSeq 6000進行測序，兩個親本SP、RP測序數據分別為82.25Gb、68.99Gb；兩個混池SB、RB的測序數據分別為111.7Gb、110.17Gb。

研究結果

01

將reads與親本比對鑒定SNPs

將兩個混池的reads比對到SP的參考序列，抗病、感病混池的覆蓋度為93.15%、93.04%；鑒定到164,522個SNPs；使用RP序列作為參考序列，抗病、感病混池的覆蓋度為93.09%，92.98%；得到243,380個SNPs。

02

抗青枯病的候選區域鑒定

使用鑒定到的SNP計算了SB、RB的SNP-index，並得到了ΔSNP-index。通過滑窗分析，將SNP-index顯著偏離0.5及ΔSNP-index顯著偏離的區域定位為候選區域。

本研究使用SP序列作為參考序列，在B02染色體上定位到候選區間，長度為3.35Mb(3.25-6.60Mb)；使用RP序列作為參考序列，定位到了2個候選區間，分別為B02上的3.25-6.90Mb區域及B09染色體上13.55-16.40Mb區間內的2.85Mb。

03

通過遺傳圖譜確認鑒定的候選區域

為了驗證並縮小B02上的候選區域，對28個ΔSNP-index較高的SNP開發了KASP標記，用這些標記對RILs群體進行基因分型並構建了遺傳圖譜，圖譜長度為38.14cm。並採用複合區間作圖法對3個環境下記錄的表型值進行了QTL定位，LOD值在6.53-17.23，表型解釋率為14.4-29.32%；單標記分析法也證明了3個標記和青枯病抗性存在顯著關聯。因此，將B02上的候選區間縮小到了2.07Mb(3.74-5.81Mb)。對B09上的候選區間開發了8個KASP標記進行驗證，構建圖譜長度為4.86cm；但複合區間作圖法及單標記分析法都證明該區間沒有穩定且主效QTL；結合之前基於SSR標記研究鑒定到的5個QTLs,在B09上沒有鑒定到QTL，因此認為B02上的2.07Mb區域含有抗青枯病的穩定的主效QTL，且抗性等位位點來自於Yuanza9102。

圖1花生中青枯病抗性鑒定的QTL-seq流程

04

青枯病抗性的候選基因

在這2.07Mb區域中，有348個有效SNPs，其中246個是使用兩個親本做參考序列都能鑒定到的；76、26個分別是用其中一個親本做參考序列鑒定到的；有49個非同義突變SNPs，有19個候選基因。

在這19個發生非同義突變的基因中有7個能編碼NBS-LRR型的抗性蛋白，包括Araip.G1MIP, Araip.VE4DY, Araip.05JB8, Araip.YCN52, Araip.U0YME, Araip.WF303 和Araip.65IVT。

圖2鑒定的與青枯病抗性有關的NBS-LRR抗性蛋白

05

診斷標記的驗證

用位於B02上2.07Mb基因組區域上的3個SNP標記對21個抗病材料和9個感病材料進行驗證(材料由抗病品種Yuanza9102和感病品種Zhonghua5雜交得到)。有2個標記(Araip_B02_3740746和Araip_B02_5804063)能夠將抗病材料和感病材料分開。標記Araip_B02_3740746在抗病親本中擴增出來CC等位基因型，在感病親本中擴增出AA等位基因；第二個標記Araip_B02_5804063在抗病親本中擴增出GG等位基因型，在感病親本中擴增出TT等位基因型。所有21個抗病材料都為CCGG基因型，而9個感病材料為AATT基因型。然後對由Yuanza9102與其它兩個抗病親本得到的2個抗病材料進行鑒定，發現他們都含有CCGG基因型；而對其它的13個感病材料和13個抗病材料進行鑒定，發現他們都擴增出了AATT基因型。說明來自於Yuanza9102的抗性等位基因可能與其它13個抗性材料的不同。

然後根據這兩個標記將RILs群體分成了CCGG、AATT基因型的兩類，發現59個CCGG型的材料的平均存活率為74.45%，要顯著高於78個AATT型的(34.17%)。表明來自Yuanza9102的抗性等位基因能夠顯著提高花生青枯病抗性。通過上述研究，表明Araip_B02_3740746、Araip_B02_5804063這兩個標記對於培育具有青枯病抗性的材料是有用的。

圖3青枯病抗性診斷標記的驗證

本研究亮點

1、使用了2個親本的參考序列對2個混池進行分析，提高了定位的準確性；結合連鎖分析，進一步驗證了定位結果並縮小了候選區間。

2、成功定位到了青枯病的候選區域，且開發了診斷標記，有利於加快花生抗青枯病品種的分子育種。

微分基因是一家藉助於國際領先的高通量測序平台，為生命科學研究和基因檢測提供整體解決方案的高新科技企業。致力於將生命科學研究和健康管理與疾病診療領域的測序數據進行產業化應用，推動基因科技成果轉化。

2017年3月，微分基因入駐國家大基因中心，成為國家大基因中心「基因檢測平台」運營企業，並成立安徽微分基因科技有限公司。8月，位於安徽巢湖的標準潔凈實驗室及醫學檢驗所啟動運營，佔地約2100平方米。10月，全貫穿的基因檢測平台、大數據處理平台、高通量自動化樣本處理平台、一流的生物樣本庫開始正式運作。

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