輸尿管的近紅外熒光腹腔鏡檢查用豬模型中的三種臨床前染料

概要

背景

據報道，在1-7.6％的結腸直腸手術中發生輸尿管損傷。為減少輸尿管損傷的發生率，必須確定輸尿管。在靜脈注射染料中使用近紅外熒光（NIRF）成像可能對腹腔鏡檢查期間的輸尿管可視化具有附加價值。本研究的目的是評估三種臨床前染料的性能; IRDye800BK，IRDye800NOS和IRDye800CW，用於豬輸尿管的近紅外熒光腹腔鏡檢查。

方法

在三隻雌性荷蘭長白豬中，對新染料進行了評估。在每隻豬中，使用濃度為1mg / ml的6mg靜脈內劑量測試1種染料。使用腹腔鏡成像系統以熒光模式和白光模式進行成像。為了進一步評估染料，進行了離體成像實驗，其中在PBS中稀釋的每種染料的8個遞減濃度在透明的試管中用NIRF模式在距離的1.5和10cm的距離處進行評估。腹腔鏡。

結果

所有三種染料都能有效地用NIRF成像鑒定輸尿管。對於IRDye800BK，IRDye800NOS和IRDye800CW，輸尿管分別在35,45和10分鐘後變為熒光，最大目標背景比（TBR）分別為2.14,0.66和1.44。在離體成像實驗中，所有三種染料在所有濃度下產生強熒光信號並評估所有距離。

結論

靜脈注射臨床前染料IRDye800CW，IRDye800BK和IRDye800NOS有助於成功識別活豬模型中輸尿管的解剖過程。使用IRDye800BK測得的TBR最高。在體外，在信號的熒光強度與染料濃度和與物體的距離之間觀察到相關性。

關鍵詞：熒光染料，腹腔鏡結直腸手術;近紅外熒光成像;輸尿管

據報道，1％的發病率高達7.6％，輸尿管損傷的發生是結直腸手術中令人擔憂的併發症之一[1-4]。輸尿管損傷可導致疼痛，腹腔內敗血症，全身感染，膿腫，尿路，輸尿管狹窄，輸尿管瘺，腎功能衰竭和同側腎臟單位丟失[4-6]。

未能確定相關解剖結構似乎是導致輸尿管損傷的主要因素[7]。因此，為了避免輸尿管損傷，必須在手術期間識別兩個輸尿管。然而，這可能是困難且耗時的。輸尿管支架置入術是一種可用於開放手術以幫助識別輸尿管的技術[4]。然而，在腹腔鏡手術中，觸覺反饋受到限制，這種應用幾乎沒有用。因此，需要一種改善腹腔鏡手術中輸尿管可視化的技術。近紅外熒光（NIRF）成像的使用可能能夠滿足這種需要。這項技術已經用於肝膽外科手術，以顯示膽管[8]或肝臟灌注[9]，並在結腸直腸手術中用於評估腸吻合的灌注[10-15]。關於使用NIRF成像識別輸尿管的一些研究也已發表。

腹腔鏡手術中最常用的熒光染料是吲哚菁綠（ICG）。然而，靜脈注射這種染料不利於輸尿管的可視化，因為它完全由肝臟清除，因此不能通過尿液排出[16]。或者，如果通過輸尿管支架給葯，ICG可能有可能使輸尿管可視化[17,18]。這種技術的缺點包括其侵襲性，膀胱鏡檢查的要求和可能的併發症，如尿路感染，腎積水和血尿[4]。這表明在腹腔鏡檢查期間使用ICG對於輸尿管的可視化來說是不太理想的選擇。

以上說明需要一種有效的熒光染料，它可以靜脈內給葯，被腎臟清除並且沒有副作用。先前的一項研究表明，臨床前IRDye800CW（LI-COR Inc.，Lincoln，NE，USA）在豬模型中提供了清晰的輸尿管可視化[19]，因此有可能成為這種染料。由於這種染料對於這種應用來說非常昂貴，IRDye800CW的製造商開發了兩種新的，更便宜的染料：IRDye800BK和IRDye800NOS。這些染料在靜脈給葯後被證明在膽囊管和膽囊動脈可視化方面非常有前途[20]。它們都被肝臟和腎臟部分清除，這使得它們在靜脈內給葯後有資格用於輸尿管的NIRF成像。

本研究的目的是評估IRDye800BK，IRDye800NOS和IRDye800CW在近紅外熒光腹腔鏡檢查中對豬輸尿管進行可視化的性能。

材料和方法

該研究在馬斯特里赫特大學（荷蘭馬斯特里赫特）的中心動物設施進行。動物的使用符合荷蘭有關動物研究的法規，該研究是根據當地動物倫理委員會批准的方案進行的。選擇豬模型是因為豬解剖學和人體解剖學之間的相似性以及早期在豬中成功應用NIRF成像[19]。實驗在三隻雌性荷蘭長白豬（每隻體重40kg）中進行。

腹腔鏡熒光成像系統

使用具有基於氙的光源的腹腔鏡熒光成像系統（Karl Storz GmbH＆CO.KG，Tittlingen，Germany）。該系統能夠激發和檢測本實驗中使用的所有三種染料：IRDye 800CW（?EX/ EM = 775/796 nm），IRDye800BK（?EX/ EM = 774/790 nm）和IRDye800NOS（?EX/ EM = 767/786 nm）。所有程序均使用內置記錄設備進行數字記錄。對於所有測試的三種染料，使用相同的NIRF成像設置。

染料的特性和製備

IRDye800CW是一種四磺化七甲基吲哚菁染料。靜脈注射後，它被腎臟清除並排泄到尿液中。它也被肝臟部分清除並排泄到膽汁中。因此，它可用於膽管和輸尿管可視化。其最大吸收發生在775nm，其最大激發發射在796nm。IRDye800CW的分子量為1090.11 Da [21]。

IRDye800BK和IRDye800NOS是兩種新開發的染料。IRDye800BK是一種親水性染料，最大吸收波長為774 nm，最大發射波長為790 nm。由於其親水性，它主要由腎臟清除。這使得染料特別適用於術中輸尿管成像。然而，肝臟有一些清除。

IRDye800NOS親水性較差，因此主要通過肝臟清除。這在理論上使其特別適用於膽道系統的可視化。然而，這種染料也部分地由腎臟排泄，因此也可以促進輸尿管的可視化。最大吸收發生在767nm，最大發射在786nm。

按照製造商的說明製備和使用染料。

手術技術和評估指南

外科手術是在全身麻醉下進行的，如之前在早期研究中所述[20]。外科住院患者進行了腹腔鏡下部分切除雙子宮的子宮，模仿腹腔鏡闌尾切除術。這些程序由兩位專家內窺鏡胃腸外科醫生（NB和LS）嚴格監督。每隻豬靜脈注射三種染料中的一種，總劑量為6mg（1mg / ml）。

在熒光模式和白光模式下間歇地進行成像。術中，第一作者（MA和JvdB）通過填寫登記表，系統地記錄是否可以通過熒光模式識別輸尿管。諮詢了主治外科醫生，以便就輸尿管的識別達成一致意見。如果經驗豐富的外科醫生確定其定位，則將結構定義為「已識別」。

離體NIRF成像

在離體實驗中，在完全變暗的房間中以NIRF模式評估在PBS中稀釋的8個降低的染料濃度，腹腔鏡分別保持在1,5和10cm的距離。在透明的1??0ml試管中裝入10ml各染料濃度。初始稀釋液由10毫克染料稀釋於10毫升PBS中組成。從該鹼性濃度，降低染料濃度。評估的染料/ PBS濃度為1：1,1：2,1：4,1：8,1：16,1：32,1：64和1：128。

術後分析熒光

為了客觀評估熒光照射，使用OSIRIX Lite v9成像軟體（Pixmeo，Geneva，Switzerland）。通過確定熒光強度（FI）和靶 - 背景比（TBR）來分析熒光。通過這樣做，可以客觀化目標器官（輸尿管）與周圍組織相比是否更加熒光。TBR定義為目標（輸尿管）中三個感興趣點的平均熒光強度（FI以任意單位，AU），減去背景中三個感興趣點的平均熒光強度除以三個平均熒光強度背景中的興趣點。式中：TBR =（目標的FI - 背景的FI）/（FI背景）[19,20,22]。在這些感興趣的點上避免了具有光散射的區域。由於完全變暗的房間，離體實驗中的背景FI可忽略不計，因此沒有計算出TBR。

對於目標的FI，在輸尿管中選擇三個位於中心的感興趣區域。這三個區域的平均熒光強度是目標的FI。使用此技術建立TBR時，選擇可重現的背景非常重要。因此，作為背景3，在體內研究中選擇距離輸尿管1cm雙側（右側2個和左側1個）的感興趣區域。這三種熒光強度的平均分數用作背景的FI。

對於離體研究，選擇填充有染料稀釋度的試管中心的三個目標區域的平均值作為靶標。

結果

在所有三個實驗中，有可能通過NIRF成像成功識別輸尿管。在手術期間獲得的結果以表1中的術中登記表格呈現。熒光模式的代表性屏幕截圖由三隻豬中的每一隻製成。

表格1

術中登記表

首次見證輸尿管的鑒定是在用三種染料染色後幾分鐘內發生的。輸尿管壁與子宮，腸和淋巴結一起在NIRF模式下變為熒光。尚未看到輸尿管內尿液的蠕動。因此，作者無法在此階段絕對確定輸尿管的過程。

在IRDye800BK染料給葯後35分鐘，由於尿液中排出的熒光染料，尿液的蠕動運動在NIRF模式下清晰可見。在染料給葯後3.5小時，輸尿管保持熒光直至最終評估。測得的最高TBR為2.14（圖1a）。

圖1

使用實驗染料可視化輸尿管：a使用IRDye800BK，最高TBR（2.14），b使用IRDye800NOS，最高TBR（0.66），c使用IRDye 800CW，TBR最高（1.44）

第二隻豬（IRDye800NOS）中輸尿管的熒光首次出現在染料給葯後45分鐘，輸尿管內有明顯的尿蠕動。測得的最高TBR為0.66（圖1b）。

在第三隻豬中，在施用IRDye800CW染料後10分鐘發生輸尿管的第一次熒光成像。兩種輸尿管都與周圍環境明顯不同。在染料施用後25分鐘的第二次評估顯示在NIRF模式下輸尿管的持續清晰描繪。測得的最高TBR為1.44（圖1c）。

在任何實驗中均未觀察到併發症或不良反應。

離體NIRF成像

使用所有三種染料，在所有濃度和所有距離下都獲得了強熒光信號。結果如圖2a-c所示。

圖2

用於不同染料濃度的三種染料的熒光強度（FI），腹腔鏡保持在離物體1cm，b5cm和c10cm處。1：1,2：1等：初始染料濃度的稀釋液（見文）

在1厘米距離處，所有濃度的所有染料都顯示出相當的FI，沒有明顯的波動。在5厘米距離處，所有染料的FI在最高濃度下較低。在這些濃度下，IRDye800CW顯示出最高的FI。這種效果在較低濃度下消失。在10cm距離處，對於所有三種染料也觀察到濃度和FI之間的反比關係。與IRDye800NOS相比，IRDye800CW和IRDye800BK在所有濃度下都顯示出更高的FI。當腹腔鏡保持在10cm距離時，與分別保持在1和5cm距離時相比，所有三種染料均顯示FI減少。對於較高濃度，在1cm距離處實現最高FI，對於較低濃度，在5cm距離處實現最高FI。

討論

最常用的近紅外熒光染料吲哚菁綠僅由肝臟清除[20]，因此靜脈注射後不能用於輸尿管成像。這種成像需要在尿液中排出的染料或輸入輸尿管的侵入性技術，熒光染料可以通過輸尿管插入其腔[18,23]。

Verbeek等人。在12例患者的開放式盆腔手術中使用亞甲藍作為熒光染料用於輸尿管可視化。在所有12名患者中，輸尿管可以清晰可見[24]。Yueng等。顯示11名患者中有10名患者輸尿管可視化。該技術在這10個案例中有4個被認為是有用的。Barnes等人最近的一項研究。在一項臨床研究中顯示了有希望的結果，允許輸尿管的可視化，其中亞甲藍的熒光成像與評估的69個輸尿管中的14個中的白光相比具有附加值[25]。然而，在腹腔鏡結腸直腸手術中使用亞甲藍作為熒光染料的另一項研究中，在任何一種病例中都沒有發現這種技術優於傳統的白光腹腔鏡檢查[26]。儘管在這些研究中沒有報道副作用，但使用亞甲藍的缺點是它具有一些潛在的副作用，例如過敏反應的風險很小[27]和血管收縮的可能發生。

一種有前途的近紅外熒光染料被腎臟清除，是IRDye800CW[23]。但是，這種染料對於這種應用是昂貴的。生產成本較低的較新的臨床前染料是IRDye800NOS和IRDye800BK。製造商估計其成本在商用ICG（個人通信）的範圍內。在本研究中，探討了三種臨床前染料對輸尿管NIRF成像的有效性。IRDye800BK專為通過尿液排泄而開發，具有親水性。因此，預計該染料將等於或優於先前針對IRDye800CW所述的成像能力[20]。

所有三種染料都能使兩種輸尿管的解剖過程清晰可見，如圖1a-c所示。使用IRDye800BK測量最高的最大體內FI和TBR，並且在IRDye800NOS中發現最低的最大FI和TBR。這符合預期，因為親水性IRDye800BK主要由腎臟清除，而IRDye800NOS親水性較低，僅部分被腎臟清除。然而，所有三種染料都能清楚地看到輸尿管。IRDye800CW的TBR與之前的實驗相當[19]。

在離體研究中，在所有濃度和所有測試距離下都獲得了清晰的熒光信號。當腹腔鏡保持在1和5cm距離時實現最高FI，而在10cm距離處實現最低FI。這支持早期的研究，這些研究表明，腹腔鏡距目標的距離增加會對FI產生負面影響[28]。

評估更多濃度和距離的進一步研究可能有助於確定理想的距離/濃度組合。

由於染料的給葯，沒有不良反應。使用靜脈注射熒光染料已知SpO2氧飽和度短暫下降，暫時導致氧含量錯誤降低[29,30]。這些新染料相對於含碘ICG的優點是這些染料也可用於已知對碘或碘過敏的超敏感性的患者。由於評估的豬數量較少，尚未得出關於染料安全性的結論。

儘管結果很有希望，但本研究的結果必須謹慎解釋。由於每種染料僅在一種特定劑量下在體內進行測試，並且每種染料僅在一隻豬中進行測試，因此需要進一步的實驗來確定染料的最佳劑量和時間，這取決於染料的葯代動力學性質。此外，應該等待人類受試者的測試以評估染料的臨床價值。

結論

靜脈注射臨床前染料IRDye800CW，IRDye800BK和IRDye800NOS可以成功識別生豬模型中輸尿管病程的NIRF。IRDye800BK的使用導致輸尿管和背景之間的對比度最高。

在體外，觀察到信號與染料濃度和與物體的距離的相關性。

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