新型RNA編輯系統問世！編輯效率可達80％

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谷 君 說

在一項新的研究中，中國北京大學魏文勝（Wensheng Wei）課題組描述了一種使用內源性ADAR進行RNA編輯的替代方法。他們證實表達招募ADAR的RNA（ADAR-recruiting RNA, arRNA），能夠實現對內源性RNA進行高效而又精確的編輯，並且成功地校正致病性突變。

中國科學家開發出一種新型RNA編輯系統，編輯效率最高可達80%

文/towersimper

使用工程核酸酶的基因組編輯技術，比如鋅指核酸酶（ZFN）、轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALEN）和CRISPR系統中的Cas蛋白已被用於操縱許多有機體的基因組。最近，科學家們已將胞苷脫氨酶或腺苷脫氨酶與CRISPR-Cas9融合在一起，構建出可編程的DNA鹼基編輯器，從而為校正致病性突變提供新的機會。除了對DNA進行編輯之外，ADAR腺苷脫氨酶也被用於對RNA進行精確編輯：將腺苷（A）轉換為肌苷（I），即AI轉換。三種類型的ADAR蛋白已在哺乳動物中鑒定出：ADAR1（異構體p110和p150）、ADAR2和ADAR3，它們的底物都是雙鏈RNA（dsRNA）。在翻譯期間，肌苷被認為在模擬鳥苷（G）。

圖片來自Thomas Splettstoesser (Wikipedia, CC BY-SA 4.0)。

為了實現靶向RNA編輯，ADAR蛋白或者它的催化結構域與一種λN肽、一種SNAP標籤或一種Cas蛋白（dCas13b）融合在一起，而且嚮導RNA（gRNA）經設計後將這種融合的ADAR蛋白招募到特定位點上。此外，人們還報道，過量表達的ADAR1或ADAR2蛋白與帶有R/G基序的gRNA一起也能夠實現靶向RNA編輯。

在哺乳動物系統中，所有這些報道的核酸編輯方法都依賴於兩種組分---一種酶和gRNA---的異位表達。儘管這些雙組分核酸編輯系統在大多數研究中高效地發揮作用，但是一些遺傳障礙限制了它們的廣泛應用，特別是在治療方面。這是因為體內最有效的基因治療遞送方法是通過病毒載體實現的，而且高度理想的腺相關病毒（AAV）載體遞送的貨物（指的是編碼這兩種組分的DNA）大小是有限的，大約為4500個鹼基，這就使得利用病毒載體容納這兩種組分充滿挑戰。

科學家們最近已報道，ADAR1的過度表達因對RNA進行異常的高度編輯而在多發性骨髓瘤中具有致癌性，並可產生大量的全局性的脫靶編輯。蛋白或它們的非人類來源的結構域的異位表達也存在著引發免疫原性的潛在風險。再者，預先存在的適應性免疫和p53介導的DNA損傷反應可能會破壞諸如Cas9之類的治療性蛋白的功效。

RNA編輯的內在作用機制可通過將預組裝的靶轉錄物---RNA雙鏈體---注射到非洲爪蟾的胚胎中加以實現。2019年1月，Stafforst及其同事們報道了一種稱為RESTORE的RNA編輯方法，它的作用機制是使用經過複雜化學修飾的化學合成反義寡核苷酸來招募內源性的ADAR。

如今，在一項新的研究中，中國北京大學魏文勝（Wensheng Wei）課題組描述了一種使用內源性ADAR進行RNA編輯的替代方法。他們證實表達招募ADAR的RNA（ADAR-recruiting RNA, arRNA），能夠實現對內源性RNA進行高效而又精確的編輯，並且成功地校正致病性突變。相關研究結果於2019年7月15日在線發表在Nature Biotechnology期刊上，論文標題為「Programmable RNA editing by recruiting endogenous ADAR using engineered RNAs」。

魏文勝課題組將這種方法稱為LEAPER（leveraging endogenous ADAR for programmable editing of RNA, 利用內源性ADAR對RNA進行可編程編輯）。具體而言，LEAPER利用經過改造的arRNA招募天然的ADAR1或ADAR2酶，從而將特定的腺苷轉變為肌苷。

他們發現由質粒或病毒載體或者作為合成寡核苷酸遞送的arRNA都可實現較高的編輯效率，最高可達80％。LEAPER是高度特異性的，具有極低的全局性脫靶編輯率，而且在靶區域中對除腺苷之外的鹼基進行有限的編輯。

此外，魏文勝課題組發現LEAPER在包括多種人原代細胞在內的很多細胞類型中具有活性，並且能夠在源自赫爾勒綜合症（Hurler syndrome）患者的原代成纖維細胞中恢復α-L-艾杜糖醛酸酶（α-L-iduronidase）的催化活性，而不會引起先天性免疫反應。

由此可見，魏文勝課題組發現具有足夠長度的線性arRNA的表達可引導內源性ADAR蛋白在靶轉錄物上進行鹼基編輯：將腺苷轉化為肌苷。相比於現有的編輯方法，LEAPER有幾個優點。arRNA分子較小的尺寸讓人想起RNA干擾（RNAi），在RNAi中，小的雙鏈RNA分子誘導一種實現RNA靶向降解的天然機制，再者，這種較小的尺寸使得能夠通過各種病毒載體和非病毒載體加以遞送。不同於RNAi的是，LEAPER催化精確的AI轉換，而不會切割或降解靶轉錄物。

雖然arRNA的長度要比RNAi長，但是arRNA既不誘導細胞水平上的免疫刺激作用，也不影響內源性ADAR蛋白的功能，這就使得它成為一種靶向RNA的安全策略。

相反之下，人們已報道ADAR蛋白或它們的催化結構域的異位表達誘導了大量的全局性的脫靶編輯，並且可能誘發癌症。類似地，據報道，由於效應蛋白的表達，DNA鹼基編輯器在小鼠胚胎、水稻或人細胞系中產生了大量的脫靶單核苷酸突變。LEAPER實現了高效編輯，而且同時很少發生全局性脫靶編輯。此外，它可能比需要引入外源蛋白的方法具有更低的免疫原性。

與Stafforst團隊在2019年1月報道的一種稱為RESTORE的RNA編輯方法相比，LEAPER中的arRNA可通過多種方式產生，包括化學合成和利用病毒載體或非病毒載體進行體內表達，然而，RESTORE中的gRNA僅限於依賴於複雜化學修飾的化學合成反義寡核苷酸。

LEAPER的效率和特異性仍有改進空間。與招募ADAR的支架RNA（scaffold RNA）融合在一起的arRNA可能增加局部的ADAR蛋白濃度，從而提高編輯收益率。讓arRNA保持穩定或增加它表達的方法可能進一步提高RNA編輯效率。作為一種單分子系統，LEAPER實現精確而又高效的RNA編輯，有潛力廣泛地適用於治療和基礎研究。

在幾天之前，美國麻省理工學院麥戈文腦科學硏究所研究員、布羅德研究所核心成員張鋒（Feng Zhang）及其團隊如今開發出一種稱為RESCUE（RNA Editing for Specific C to U Exchange, CU交換特異性的RNA編輯）的策略：利用一種失活的Cas13將RESCUE引導到RNA轉錄本中的目標胞嘧啶鹼基上，並使用一種新的、經過進化的、可編程的酶將不想要的胞嘧啶（C）轉化為尿苷（U），從而指導RNA指令發生變化。RESCUE建立在REPAIR技術的基礎之上，其中REPAIR也是由張鋒團隊開發的，可將鹼基腺嘌呤轉化為RNA中的肌苷（Science, 2017, doi:10.1126/science.aaq0180，詳細新聞報道參見生物谷報道：重磅！Nature和Science同日打擂台發表新型DNA/RNA鹼基編輯器，可校正點突變）。相關研究結果於2019年7月11日在線發表在Science期刊上，論文標題為「A cytosine deaminase for programmable single-base RNA editing」。

CRISPR家族酶Cas13在發揮作用。Cas13（粉紅色）是RESCUE平台的核心，它使用特定的嚮導分子（紅色）靶向細胞中的RNA（藍色）。圖片來自Stephen Dixon。

之前開發的REPAIR平台使用靶向RNA的 CRISPR/Cas13將一種稱為ADAR2的RNA編輯器的活性結構域引導至特定的RNA轉錄物，在那裡它能夠將腺嘌呤（A）轉換為肌苷（I），即AI。由於不存在具有替代活性的天然編輯器，張鋒和他的同事們進行了REPAIR融合，並在實驗室中讓它進行進化，直到它能夠將胞嘧啶轉換為尿苷，即CU。

RESCUE能夠被引導至任何選擇的RNA，然後通過這種平台中經過進化的ADAR2組分執行CU編輯。張鋒團隊將這種新平台導入到人細胞中，結果表明這能夠靶向人細胞中的天然RNA以及合成RNA中的24種臨床相關突變。然後，他們進一步優化了RESCUE以減少脫靶編輯，同時最小程度地降低對在靶編輯的干擾。

綜上所述，魏文勝課題組開發的LEAPER工具和張鋒團隊開發的RESCUE工具能夠填補核酸編輯工具箱中的關鍵空白，有助於推動科學家們實現更精確的RNA編輯，並且最終有助於治療一系列由突變引起的疾病。

參考資料：

2. Omar O. Abudayyeh et al. A cytosine deaminase for programmable single-base RNA editing. Science, Published online:11 July 2019, doi:10.1126/science.aax7063.

3. David B. T. Cox et al. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science, Published online:25 Oct 2017, doi:10.1126/science.aaq0180.

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