Ago蛋白，基因編輯的新工具？專訪王皓毅

撰文 | 王承志

責編 | 陳曉雪

2019年7月30日，《細胞發現》（Cell Discovery）雜誌在線發表了中科院動物研究所王皓毅團隊和中科院北京生命科學研究院趙方慶團隊的最新研究 [1]，報道了兩種來自人類胃腸道細菌的兩種 Argonaute（Ago）蛋白，它們可以在生理溫度（37℃）下在 DNA 引導下實現對 DNA 單鏈和雙鏈的切割。 這引發了人們的一系列問題：Ago 是否具有作為基因編輯工具的潛力？與目前當紅的基因編輯工具 CRISPR 相比效果如何？這與曾經備受關注的韓春雨聲稱的NgAgo可做基因編輯工作有什麼聯繫？

人類腸道菌群的Ago蛋白可切割DNA

Argonaute 蛋白是一類 DNA或RNA 介導的 核酸 內切酶。之前曾有研究表明，一些原核嗜熱菌的同源 Ago 蛋白能夠在 DNA 鏈引導的條件下切割 DNA [2，3，4]，可能有發展為基因編輯工具的潛力。但這些酶只能在65°C以上的高溫環境下工作，因此尋找在常溫下工作的 Ago 蛋白是一項有吸引力的任務。 王皓毅團隊和趙方慶團隊將目光聚焦到人的腸道菌群。和之前報道的嗜熱菌不同，這些細菌在人體中生活，因此它們的酶也應該在生理溫度下有活性。 通過 PFAM 隱馬可夫模型來識別已發表的人類腸道菌群中可能的Ago蛋白，研究人員發現來源於 Clostridium perfringens 的 CpAgo蛋白和來源於Intestinibacter bartlettii 的 IbAgo 蛋白在 PIWI 結構域中具有保守的催化四分體 （DEDD 或 DEDH），提示它們可以具有催化活性。 通過酶學實驗，研究人員發現這兩種 Ago 蛋白的確具有在 DNA 引導下進行 DNA 切割的能力。進一步的研究發現這兩種 Ago 有一定的序列和結構偏好性，例如富集 AT 的 DNA 鏈相比富集 GC 的 DNA 鏈更容易被它們切割，具有超螺旋結構的 DNA 能夠被切割，而線性化的 DNA 雙鏈片段則不行（圖1）。

圖1：CpAgo和IbAgo具有底物偏好性。圖片來源：參考文獻[1] 相較於已經日趨成熟的 CRISPR 基因編輯系統，Ago 蛋白具有 DNA 介導，且蛋白分子小的優勢。因此，尋找能在常溫下進行基因編輯的 Ago 蛋白一直是領域裡的一個研究方向。 2016年，河北科技大學的韓春雨課題組在《自然·生物技術》（Nature Biotechnology）雜誌發表論文，報道在格氏嗜鹽鹼桿菌（Natronobacterium gregoryi）找到了一種能在生理溫度下，在真核細胞內進行基因編輯的 Ago 蛋白，簡稱為 NgAgo。但其後由於沒有實驗室能夠重複出該結果，韓春雨課題組撤回了該論文。 此後，陸續有研究報道 NgAgo 能夠在大腸桿菌中增強同源重組，以及在斑馬魚中可以調低基因的表達 [5]，但迄今尚無證據證明其在真核細胞中的基因編輯能力。

從0到1 的突破更難

那麼，Ago 蛋白是否有成為基因編輯工具的潛力？ 《細胞發現》一文的通訊作者王皓毅介紹說，他的課題組一直在嘗試 CpAgo 和IbAgo 在真核細胞內的基因編輯活性，但目前還沒有得到陽性的結果。另外，正如論文中所描述的，CpAgo 和 IbAgo 具有一定序列和拓撲結構的偏好性，這可能是由於這些 Ago 蛋白並沒有解旋酶的活性。因此，王皓毅認為，目前的兩個Ago 蛋白只是在體外表現出一定的切割 DNA 的活性，很難與已經非常高效的CRISPR 相比較。 王皓毅推測說，之前的實驗表明 CpAgo 和 IbAgo 在超螺旋的 DNA 結構上有活性，這是因為超螺旋結構是有助於 DNA 雙鏈解旋。而在細胞內，基因組處於動態變化過程，一些位點可能產生解螺旋，從而適合 Ago 蛋白切割。他的課題組在一些基因組位點上已經做了初步嘗試，但目前還沒有看到陽性結果。這可能是由於複雜的染色質結構，包括很多結合在 DNA 上的蛋白 複合物等干擾了 Ago 蛋白在體內的作用。 王皓毅同時也表示，雖然目前還沒有證據證明 Ago 蛋白可以在體內發揮基因編輯的作用，但不能認為繼續探索 Ago 的體內活性就沒有意義。例如，CRISPR 有很多種類型，其中有一些是以單鏈 RNA 介導切割單鏈 DNA 的，這與 Ago 蛋白在體外的活性很相似。王皓毅指出，如果最初科學家挑選了這些 CRISPR 去研究，很可能得出的結論是 CRISPR 是切割單鏈 DNA 的。「不去發現，就永遠不會知道會發現什麼。」 當被問及 Ago 蛋白是否有作為基因編輯工具的潛力，王皓毅認為，這種潛力還是存在的。但當前首先要攻克的是，在體內能夠得到可以重複的，讓人確信的陽性結果。 「你必須得保證，尤其如果（編輯）效率低的話，你必須得保證你的檢測是足夠靈敏和特異的，從而確保檢測的不是假陽性。」 王皓毅表示，只有在確認體內能夠進行基因編輯的基礎上，才可以進行各種優化，創造出適合科學家使用的分子工具。 他同時指出，如果進行優化是從1到100，「相對容易一些」，發現其體內確證的活性則是從0到1，才算是真正的突破，也 「更困難一些」。

「韓春雨並不能壟斷Ago這個名字」

在本次發表的論文中，新發現的 CpAgo 和 IbAgo 與之前韓春雨論文報道的NgAgo 在進化聚類上比較接近（圖2），一些報道稱這表明「韓春雨的思路並沒有錯」。 「做 Ago 的都成了拾韓春雨的牙慧了……」 看到上面的標題，王皓毅哭笑不得。「韓春雨並不能壟斷 Ago 這個名字……這些標題也就是想蹭熱度，是標題黨吧。」 王皓毅指出他自己開始關注 Ago 作為一個潛在的基因編輯工具，「基本上是從2014年的那篇 Nature（論文）開始的 [2]，就是荷蘭的那個團隊，他們長期在做CRISPR 和 Ago 的相關研究工作」。五年前，荷蘭瓦赫寧根大學的微生物學家John van der Oost 等人的研究發現，TtAgo 蛋白在高溫下可以進行基因編輯。「從那個時間點開始，我相信我的很多同行，包括我自己，都開始探索這方面（Ago作為基因編輯工具）的可能性。」 「所以說，韓春雨做的事情，你也可以說是他的思路，當然這個思路並不是他獨有的，這個思路是非常 obvious（顯然）的，包括我們當時其實也在看另外一個常溫的 Ago，只不過我們都沒有看到陽性結果。」 王皓毅說。 另外，王皓毅表示，NgAgo 是高鹽高鹼環境下生活的古菌，而 CpAgo 和 IbAgo是人的共生菌，「也很難說和 NgAgo 有什麼直接的關係」，更不能說明 NgAgo就可能有 DNA 切割活性。 值得一提的是，John van der Oost 團隊和 Alexei Aravin 團隊也在近期發表論文[6，7]，分別獨立發現在常溫下作用的 CbAgo，顯示在常溫下 Ago 系統也是微生物一種重要的防禦機制。

圖2：不同Ago蛋白的聚類分析。圖片來源：參考文獻[2]

製版編輯 | 皮皮魚

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