北京大學白凡研究員：單細胞技術追捕「藏匿」於血液的循環腫瘤細胞，揭示癌症轉移生物學機制

細胞是生物活動的基本功能單位，也是生命科學的核心研究對象。單細胞測序技術自2009年問世，是在單個細胞水平上，對細胞基因組、轉錄組、表觀組進行高通量測序分析的一項新技術；隨著近年來二代三代基因測序技術的迅速發展，測序通量逐漸提高，測序成本逐漸下降，這為單細胞測序的發展提供了一片沃土，使其成為生命科學裡一個非常活躍的研究領域，更多地被應用到基礎醫學和臨床轉化的研究中。

在不久前舉辦的《第二屆單細胞測序技術高端研討會》上，生物探索有幸採訪到了現任北京大學生物醫學前沿創新中心（BIOPIC）、生命科學學院研究員——白凡，並聆聽他分享了他和團隊在近些年將單細胞測序應用於癌症研究上的成果與體會。匆匆採訪，嚴謹、謙遜和親切是白凡研究員給人的最初印象。

北京大學生物醫學前沿創新中心（BIOPIC）、生命科學學院研究員

名校學子， 回報母校

據了解，白凡早前畢業於北京大學物理系，在遠赴英國牛津大學攻讀並取得博士學位後，他曾先後在牛津大學和大阪大學（日本）進行過博士後研究。2011年，滿載著國外留學和科研工作中積累的豐富學識和經驗，白凡選擇回到母校任職，並先後承擔多項自然科學基金委、科技部和北京市科委的科研項目。在北大工作期間，白凡研究員和團隊一直致力於通過對癌症病人外周血循環腫瘤細胞（circulating tumor cell, CTC）進行單細胞分析，深入探索癌症轉移的分子生物學機制以及實現無創癌症診斷、預後判斷、療效評價的臨床方法。

近年來，他們已經利用單細胞測序技術在CTC、腫瘤異質性及克隆起源等課題上取得了重大突破和進展。他們在世界範圍內第一個報道了單個CTC的全基因組測序結果並獲得廣泛關注 （PNAS，2013）；他們通過單細胞基因測序分析了結直腸癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌以及肝癌等不同癌種中CTCs的特徵與差異，進一步揭示了腫瘤轉移的分子機制和克隆起源等問題，具有重要的科學意義和臨床價值（Genome Research，2017）。近期，白凡研究團隊又把研究重點轉到了小細胞肺癌上，通過CTCs實現對小細胞肺癌腫瘤突變特徵的無創探測和病人化療敏感性的預測（Clinical Cancer Research, 2019）。

循環腫瘤細胞在癌症轉移中的中介作用

如今，CTCs的定義已經比較明確——它們是以不同形態存在於外周血中的各類腫瘤細胞的統稱，既有遊離的單個CTC，也有聚集成團的細胞團（CTM，Circulating Tumor Microemboli）。它們源於自發或臨床診療操作中從實體腫瘤病灶（腫瘤原發灶或轉移灶）的脫落，能夠越過組織間基底膜併入侵組織基質，從而進入血液循環系統。

「現在，我們對癌症轉移的關鍵步驟已經有了比較清晰的認識，而CTC在癌症轉移中起了關鍵的中介作用，」白凡研究員介紹道，「當這些CTCs進入到血液循環系統後，它們就會沿著血液快速地擴張到其他身體部位。雖然這一過程中大部分CTCs會發生凋亡或被吞噬，但少數能夠逃逸並存活。一旦這些逃逸的CTCs在一些其他組織的毛細血管里停留下來，就會啟動另一過程離開毛細血管去重新建立和發展成為新的轉移灶。這大大增加了惡性腫瘤患者的死亡風險。」

事實上，早在一個多世紀前（1869年），澳大利亞籍醫生Thomas Ashworth 就在癌症病人中首次觀測到了CTC。他發現病人外周血中一些異常形態的細胞與癌細胞非常相似，於是提出了這樣的猜測：那些異常形態的細胞是否與癌症的廣泛多器官轉移有著直接的關係呢？遺憾的是，當時Thomas Ashworth無法提取CTCs來繼續追蹤它們的「來龍去脈」。

研究者多年來都希望能夠從病人外周血中捕獲CTCs來進行更有效的研究，但這一細胞群體的數量十分稀少，而且混雜在大量的血細胞之中。條件和技術的限制使得CTCs的研究一直受阻。白凡研究員解釋說：「正常人1m?l血液里大概有1億血紅細胞，100萬左右白細胞。然而在一毫升癌症病人血液里，往往只能分離到幾個到幾十個CTC?s。因此，捕獲和分離CTCs去進一步研究是一個十分有挑戰的難題。」一些研究也表明：1 g腫瘤組織，大約有100萬個腫瘤細胞，可每日播散腫瘤細胞進入血液。然而CTCs的數量在循環血液中常呈現出動態遞減的特點，到達外周血時已十分稀少。

單細胞測序技術鑒定和表徵循環腫瘤細胞

直到近些年，對細胞富集、分離和鑒定分析等新技術的快速發展以及測序技術的飛躍重新點燃了CTCs這一領域的研究，讓CTCs作為一種臨床中切實可行的腫瘤評估方法逐漸變成可能。白凡研究團隊最早關於CTCs的研究是從分析肺癌病人CTCs的基因組拷貝數變化 （copy number variation-CNV）模式和點突變開始的。現在已經有很多的不同的方法來分離CTCs，他們主要通過目前唯一經美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准用於檢測CTCs的Cell search平台來獲取和分離單個CTC，並對其遺傳物質進行擴增和全基因組測序。這一突破性結果發表在2013年《PNAS》上，並在同年《Nature Methods》特別報道中（singled out for sequencing ）得到重點引用。

在分析了CTC單細胞全基因組的CNV模式並將該數據與相關實體腫瘤平行數據進行比較後，白凡研究團隊發現CTCs與原發位和轉移位腫瘤中存在明確的基因共同區域的缺失與擴增，而且來自同一病人CTCs 的CNV 模式具有一致性。同時，同一亞型的肺癌患者中，CNV模式在肺癌發生髮展的重要區域存在明顯的相似性（如：第8號染色體的後半段有明顯擴增）；而在不同亞型的肺癌患者中 （如肺腺癌和小細胞肺癌），CNV呈現出了不同的模式。白凡研究員總結道：「這提示可以對外周血CTCs進行全基因組CNV檢測，根據CNV推測肺癌的不同亞型。」

2013 《Nature Methods》上 singled out for sequencing 特別報道

不僅如此，白凡研究團隊還通過CTCs基因測序在肺腺癌向小細胞肺癌轉化的患者中發現，癌症治療中產生的耐藥性與特定抑癌基因的點突變具有明確相關性。結合病理判斷，他們進一步驗證了在產生耐藥性後癌症能夠以CTCs為途徑從肺部原發灶向肝部形成新的轉移灶。「這些結果說明，對CTCs的分析可以幫助獲取病人的靶向用藥、耐葯、表型轉換等臨床非常關聯的重要信息。」白凡研究員這樣評價。另外，他們還通過外周血CTCs基因測序觀測了癌症治療中不同時間點 （如化療前、一線化療和二線化療）所發生的點突變，來探知腫瘤克隆的演化過程。

在已有的肺癌研究基礎上，白凡研究團隊又將分析經驗應用到其它中國人高發的癌症中，如：對胃癌和乳腺癌進行分型、預測前列腺癌激素治療效果，鑒定結直腸癌轉移的關鍵標誌物等。他們將多個癌種的研究結果匯總，進行了跨癌種綜合分析，特別關注了與癌症轉移驅動時間相關的CNV變化，相關結果在2017年發表在《Genome Research》 上。

從單細胞層面理解腫瘤細胞異質性和克隆起源

伴隨生命科學認識的深入，研究者們越來越多地發現同一組織的細胞之間或同一類型的細胞之間事實上存在著不同程度的差異，這些差異被稱為細胞間的「異質性」。在許多生命活動的關鍵問題上，單個細胞所發揮的作用其實是非常重要的，如在胚胎髮育，腫瘤，不可培養微生物等的研究上。

腫瘤中的單個細胞間可以存在很大程度的差異，高度異質性的細胞對癌組織的表型有高度的塑造作用。白凡研究員認為，腫瘤的異質性是腫瘤在發生髮展的長期演化過程中，不同的腫瘤克隆之間存在相互競爭的情況下產生的。這種細胞間的異質性對現在的腫瘤治療帶來了很大的挑戰。

傳統研究依賴於群體細胞測量，通常把同一組織或同一類型的大量細胞作為研究對象，會掩蓋單個細胞之間的差異，因此具有局限性。白凡研究員表示，現在有了單細胞測序技術，就可以以單個細胞的精度去研究。如果再結合生物信息學的方法，就能夠準確地把整個腫瘤的異質性和它的演化歷史以最高的精度去重現。白凡研究團隊利用單細胞基因測序的結果構建了進化樹，並分析了肝癌不同亞型以及混合型肝癌的異質性。此外，他們還發現了混合型肝癌中不同克隆間獨立和共同起源並存的情況並推測了其可能的轉移路徑。相關結果於2019年發表在《Cancer Cell》上。

世界肝癌分布（A）、肝癌發病位置(B)和肝癌異質性(C) （Xueet al., 2017）

近期有一些研究表明，癌症耐藥性與不同藥物作用下細胞的異質性反應有關。對此，白凡研究員也給出了自己的看法：「癌症的耐藥性確實是一個非常複雜的問題。除了研究腫瘤細胞本身，對於免疫細胞和其它對腫瘤的發生髮展有很大促進作用的因素也要深入研究和理解。因此，可從兩個方面去考慮：第一個是遺傳層面。也就是說腫瘤細胞發生了基因型的變化，產生新的基因型來適應藥物的處理以存活下去；另一方面就是非遺傳層面，像是複雜的腫瘤微環境所帶來的影響會增強腫瘤的耐藥性，又或者是腫瘤的表型上的一些改變，比如有些腫瘤細胞能夠將一些化療藥物有效地排出來，可以稱之為『外排泵 』作用，不讓它對腫瘤細胞進行殺傷。這同樣會增強它的耐藥性。」

對未來癌症治療藥物的研發，白凡研究員也談論了一些展望。具體來說，傳統的大量樣本研究只針對一些重要的基因突變，伴隨著技術的進步，未來的癌症治療還是有很多的潛力。現在有了單細胞精度的癌症研究，研究人員就可以對腫瘤細胞裡面一些特殊的群體，比如像腫瘤幹細胞或是同時具有多種表型的腫瘤細胞，又或是對腫瘤微環境中幫助腫瘤生長的細胞類群及其它因素，進行更深入的研究和理解。這些新知識的獲取會帶來一些新的藥物設計的思路，展開一些新的癌症研究領域。

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