丙型肝炎病毒，從發現到治癒

Ralf F.W. Bartenschlager、Charles M. Rice 和 Michael J. Sofia開發了一個新的系統來研究丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV） 的複製，並且利用該系統變革了此類慢性、往往是致死性疾病的治療。他們也因此被授予2016 年度拉斯克 ? 德貝基臨床醫學研究獎。

肝臟是人體最大的器官，具有代謝等多種功能。多種病毒可感染肝臟，這些病毒被稱為肝炎病毒，已知的有 5 種肝炎病毒，包括 HCV，它一開始被認為是導致輸血後非甲非乙型肝炎的病原體。由於約 6% 的患者在輸血後出現非甲非乙型肝炎，科學家作出了巨大的努力以分離並克隆出可能的濾過性病原體，例如病毒。

在 1989 年的一篇里程碑式的文獻中，Houghton 及其團隊首次分離出了 HCV 的分子克隆，並一睹 HCV的基因組 ：正鏈 RNA 病毒，基因組長度約為 9500 個核甘酸，所編碼的長鏈多聚蛋白裂解為 8 至 10 個 產物。隨後多家實驗室確認，這些 HCV 蛋白中包括兩種病毒酶，分別是非結構蛋白 (NS)3-4A 絲氨酸蛋白酶和NS5B RNA 依賴性 RNA 聚合酶，兩者均為極具潛力的HCV 藥物靶標。隨後的研究開發出了新的 HCV 有效治療藥物。

藥物開發的瓶頸是缺乏 HCV 細胞培養系統，但HCV 分子克隆帶來了希望，這是因為正鏈 RNA 病毒的基因組具有傳染性。將含有基因組 RNA 或等價的基因組 RNA 的質粒導入受納細胞，就會啟動一個完整的病毒生命周期。這一方法在許多其他病毒上奏效，但應用 於 HCV 時卻失敗了。最後，Kunitada himotohno 和 Charles M. Rice 的實驗室發現了其中的原因 ：病毒基因組 3』末端缺失了一塊。鑒於當時我們對 HCV 基因組已經完全了解，克隆出功能性互補 DNA（complementary DNA) 應該並不難，但如果沒有細胞培養系統，如何對其進行檢測？1997 年，反映「共有」序列的克隆被用於篩選存在於人源性 HCV 中或實驗室cDNA 克隆期間獲得的致死性突變。將該人工合成的裸基因組 RNA 注射至黑猩猩肝臟，隨後出現了增殖性HCV 感染，並提供了首個遺傳系統，這證實了可能的HCV 特異性藥物靶標對於該病毒至關重要。

在已有上述具有體內傳染性的 HCV 基因組 RNA後，似乎可以預期合適的細胞培養系統將很快出現，然而情況並非如此。Ralf Bartenschlager 實驗室的工作解決了這一問題，其採用了從慢性感染患者肝臟克隆的另一種 HCV 共有基因組。還改造出了「選擇性迷你基因組」，稱為複製子（replicons），其用於分離支持穩定的HCV 複製的罕見細胞。這些複製子編碼可進行自主複製及產生細胞毒性藥物 G418 耐葯所需要的最小病毒蛋白集合。通過藥物選擇，可以分離出支持 HCV 長期複製的細胞。這一首個穩定的 HCV 細胞培養模型重現了HCV 複製周期的所有細胞內步驟，並且因為這些 HCVRNA 的複製依賴於病毒酶，最引人注目的是 NS3 蛋白酶和 NS5B 聚合酶，所以該複製系統適用於開發藥物。

Rice 和 Bartenschlager 隨後開展的研究揭開了高效複製的原因。首先選擇出細胞池中最為受納 HCV 的單個細胞 ；其次，所選細胞克隆中的複製子含有突變，該突變可成倍地增強 HCV RNA 複製。將這些突變插入親代複製子中，可對 HCV 複製進行直接測量。由此構建了首個廣泛用於研究 HCV 生物學的遺傳系統。隨後Bartenschlager、Rice 等人改良了這一方法。

在已有穩定的 HCV 複製子全細胞系統後，製藥和生物技術公司主要致力於 HCV 抑製劑研究，希望找到靶向抗病毒藥，並最終替換當前 HCV 感染的標準治療，即干擾素注射和利巴韋林的聯合治療，該聯合治療可能導致重度不良反應，治癒率不高，並且基因型覆蓋範圍有限。

2005 年，HCV 藥物研發的努力集中於數種關鍵病毒靶標，包括 NS5B RNA 依賴性 RNA 聚合酶（NS5B RdRp）。Pharmasset 公司的 HCV 複製核苷抑製劑研究 確認了一種獨特的 2′ -α-F-2′ -β-C- 甲基胞苷衍生物 PSI-6130（一種 HCV 抑製劑）。針對 HCV RdRp 的核 苷靶向藥物有望提供更為廣闊的基因型覆蓋範圍，並 防止病毒耐藥性的出現。該核苷在複製系統中顯示出 HCV 抑制作用，相比其他病毒對 HCV 有高度選擇性， 顯示出泛基因型特徵，並且證實具有高耐葯基因屏障。但是 PSI-6130 缺乏足夠的口服生物利用度資料，其代 謝後形成了大量非活性尿苷，因此到達靶標的活性藥物有限。

經初步嘗試改善 PSI-6130 後，開發出了 PSI-6130 前體藥物。在臨床研究中，PSI-6130 前體藥物驗證了 這一概念，即 2′ -α-F-2′ -β-C- 甲基胞苷在患者中抑 制 HCV，並且是首次對非基因型 1 患者有效的直接作 用抗病毒藥物。但是該候選藥物的局限性也很明顯，需 每日兩次大量給葯才能顯示出療效，並且非活性尿苷代 謝物仍然存在。

為解決 PSI-6130 前體藥物的這一不足，Sofia 及 其同事對該核苷抑製劑進行了徹底的再設計。研究顯示 該尿苷代謝物的三磷酸鹽是 HCV RdRp 的強效抑製劑， 並在人原代培養肝細胞中展現出較長的半衰期。三磷酸鹽半衰期越長，細胞內的活性藥物濃度則越高。已經確定的是，阻斷尿苷至活性三磷酸鹽的代謝轉化過程可引起其活性缺乏。該阻斷作用特異性針對尿苷至單磷酸鹽中間產物的轉化過程。

為解決將高電荷、不穩定且不能透過膜的單磷酸尿苷運輸至細胞，並最終進入機體的問題，提出了「特洛伊木馬」策略，即通過掩蔽單磷酸尿苷達到增加穩定性並促進轉運至機體和肝細胞的目的。在進入肝細胞後，該「掩蔽物」需要脫離，以暴露出單磷酸鹽，之後細胞將其轉化為三磷酸鹽抑製劑。同時，該掩蔽物還被設計為藉助肝首過效應以促進藥物的肝靶向作用，即利用肝酶選擇性地移除掩蔽物，並最終將該藥物轉移至肝細胞內。

在大量體內外臨床前開發中，評價了多種經過掩蔽的單磷酸尿苷，最終選擇了臨床候選藥物 PSI-7851。之後在一項短期研究中，PSI-7851 在接受每日一次給葯的 HCV 患者中顯示出高效性，並且未觀察到任何藥物相關不良事件或者耐葯。這一結果提供了肝靶向單磷酸尿苷前體藥物的概念驗證。在一項名為「Electron」的里程碑式臨床研究中， PSI-7977（PSI-7851 的單一同分異構）和利巴韋林聯合用藥 12 周在 HCV 基因型2 和 3 的患者中顯示出了 100% 的治癒率（定義為治療完成時持續病毒學應答）。這一結果為臨床醫生如何治療 HCV 感染患者提供了一種新方法，醫生無需再注射干擾素。PSI-7977（現稱為索菲布韋）聯合利巴韋林的3 期臨床研究證實了高治癒率，隨後索菲布韋聯合利巴韋林被美國食品藥品管理局批准用於 HCV 基因型 2 和3 的患者。但是索菲布韋聯合利巴韋林在 HCV 基因型 1的患者中並未達到較高的治癒率。

在開發出含有選擇標記和報告基因的報告複製子後，可以進行數百萬化合物的高通量篩選，由此發現了一種新型、極強效的 HCV 抑製劑，即 NS5A 抑製劑。該報告複製子的開發證實了複製子系統的多功能性，並發現了缺乏酶活性的特殊藥物靶標。隨著 NS5A 抑製劑和下一代 NS3-4 蛋白酶抑製劑的進一步開發，現已可以開展針對索菲布韋聯合用藥的臨床研究。之後還批准了多種基於索菲布韋的聯合用藥用於治療 HCV，包括首個單片、固定劑量的索菲布韋和雷迪帕韋復方製劑，其在 HCV 基因型 1 感染患者中顯示出超過 95% 的治癒率。

從確認引起肝損害的病毒到安全且高效治癒 HCV花費了 24 年。隨著時間的推移，HCV 感染必定會被冠以罕見病的稱號。

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