膽囊管和膽囊動脈的近紅外熒光腹腔鏡檢查：在豬模型中首次體驗兩種新的臨床前染料
概要
背景
增強解剖結構可視化的成像技術可以幫助預防膽管損傷。近紅外熒光成像就是這樣一種技術。以前的ICG實驗表明，肝外膽管的照射是可行的。然而，與背景相比，目標的可視化存在改進的空間。IRDye800CW的實驗顯示出有希望的結果。然而，這種染料對於常規臨床使用來說太昂貴了。本研究的目的是測試兩種新開發的臨床前染料對於膽囊管和膽囊動脈的術中成像的首次適用性，與IRDye800CW相比較。
方法
使用腹腔鏡熒光成像系統在三隻豬中進行腹腔鏡膽囊切除術。每隻豬通過靜脈注射接受6mg熒光染料之一（1mg / mL;IRDye800CW，IRDye800BK或IRDye800NOS）。在設定的時間點記錄術中識別膽道系統和膽囊動脈。數字記錄所有程序，並確定目標與背景比（TBR）以評估熒光信號。
結果
使用所有三種熒光染料，直接觀察到膽囊動脈。對於膽囊管的可視化，分別使用IRDye800BK，IRDye800NOS和IRDye800CW需要15,34和30分鐘。36分鐘後，IRDye800NOS（4.20）的膽囊管最大TBR最高，而IRDye800BK為2.45，IRDye800CW為2.15，均為45分鐘。沒有不良事件。
結論
IRDye800BK和IRDye800NOS似乎是IRDye800CW的良好替代品，可用於豬的膽囊管和膽囊動脈的可視化。
關鍵詞：熒光染料，近紅外熒光成像，膽道解剖，腹腔鏡膽囊切除術，熒光膽管造影
腹腔鏡膽囊切除術是癥狀性膽囊結石或急性膽囊炎的標準治療，是西半球最常用的外科手術之一。據報道，腹腔鏡手術中膽管損傷的發生率為0.4-1.4％[1,2]。這種損傷與發病率增加，生存率降低，生活質量受損有關，並對社會產生經濟後果[2,3]。膽管或血管系統的解剖變異並不罕見，並且代表了手術併發症和手術併發症的來源[3,4]。因此，需要增強膽道解剖結構的術中可視化以減少膽管損傷的發生率。
近紅外熒光（NIRF）成像是用於圍手術期解剖結構的實時描繪的有前景的技術。在其他應用中，它用於腹腔鏡膽囊切除術中肝外膽管和膽囊動脈的可視化，以及結直腸，泌尿外科和婦科手術中輸尿管的可視化[5-7]。在臨床環境中，ICG是用於膽管成像的染料，具有合理的可視化結果，使臨床使用成為可能。可以識別肝外膽管和膽囊動脈[8]。然而，主觀上，靶標的成像在所有患者中都不是最佳的。目標和背景之間更好的對比度預計會增加該技術的實用性。設備的適應性及其特性是解決這一問題的一種方法。染料或其使用的改變是另一種。一種這樣的改變是建議在手術前一天注射染料[9]。然而，由於通常進行當天入院，從物流的角度來看這是不可取的。應用另一種熒光染料是另一種可能性。
IRDye800CW（LICOR Biotechnology，Lincoln，United States）是一種實驗染料，與腹腔鏡成像相結合，可以在術中觀察關鍵的解剖結構。在作者小組進行的先前動物實驗中，將該染料與ICG進行比較，用於肝臟外膽管和膽囊動脈的成像。主要結果是早期可見的膽囊管，使用IRDyeCW-800和較高的囊 - 動脈靶 - 背比[10]。這與其他兩項研究一致，使這種新染料有望用於未來的臨床應用[10-12]。然而，IRDyeCW-800的一個主要缺點是其成本，幾乎是ICG的十倍。因此，需要更實惠的替代品。
最近，IRDye800CW的製造商開發了兩種新的臨床前染料，IRDye800BK和IRDye800NOS，其生產成本可與市售的ICG相媲美。通常，這三種染料具有相似的性質。發射和吸收與ICG的波長大致相同。染料的親水性不同，IRDye800NOS親水性最差。這會影響它們的排泄和它們在肝臟中的攝取，並且可能使它們在膽囊管的成像能力方面更有效。本研究的目的是使用市售的腹腔鏡熒光成像系統評估這些染料與IRDye800CW相比，用於NIRF腹腔鏡檢查肝外膽管和豬膽囊動脈的性能。
材料和方法
該研究在馬斯特里赫特大學（荷蘭馬斯特里赫特）的中心動物設施進行。動物的使用符合荷蘭動物研究立法的規定，並遵循當地動物倫理委員會批准的方案。選擇豬模型是因為它與人類肝膽解剖結構的相似性，並且因為以前成功的實驗已經在豬中進行了NIRF成像[10]。三隻雌性荷蘭長白豬，體重40公斤，用於本研究。手術後，由麻醉師處死豬。
腹腔鏡熒光成像系統
使用市售的腹腔鏡熒光成像系統（Karl Storz GmbH＆CO.KG，Tuttlingen，Germany）。NIR光源D-Light P是基於氙的系統，為近紅外波長範圍內的熒光應用提供照明光。它能夠激發所有呈現的染料：IRDye 800CW（?EX/ EM = 775 / 796nm），IRDye 800BK（?EX/ EM = 774 / 790nm）和IRDye 800NOS（?EX/ EM = 767 / 786nm）。腳踏板允許外科醫生在兩種成像模式之間輕鬆切換。所有程序均以數字方式記錄。對於所有三種染料，使用相同的NIRF成像設置。
近紅外染料的特性和製備
IRDye800CW是一種四磺化七甲基吲哚菁染料。靜脈注射由肝臟迅速清除並排泄到膽汁中。它也被腎臟清除並排泄到尿液中。該染料的峰值吸收為775nm，峰值激發發射為796nm。分子量為1090.11Da [13,14]。
IRDye800BK（LICOR Biotechnology，Lincoln，United States）是一種新開發的染料，主要用於輸尿管的術中可視化。該親水性染料的最大吸收為774nm，最大發射為790nm。由於其親水性，它主要由腎臟清除。儘管如此，在結構上與IRDye800CW相似，可以預期肝臟可以進行一些額外的清除。
IRDye800NOS（LICOR Biotechnology，Lincoln，United States）也是一種新開發的染料，親水性較差，主要用於膽道系統的術中可視化。該染料主要由肝臟清除，最大吸收為767nm，最大發射為786nm。
按照製造商的說明製備所有三種染料。將它們在無菌磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）溶液中稀釋至濃度為1毫克/毫升。製備該稀釋液中的6毫克每種染料用於靜脈內注射。
手術技術
術前用藥包括肌內注射阿扎哌隆3mg / kg，氯胺酮10mg / kg和阿托品0.05mg / kg。靜脈注射硫噴妥鈉10-15mg / kg誘導麻醉。插管後，將豬用異氟烷和氧氣保持麻醉。兩名專業的內窺鏡胃腸外科醫生（NB和LS）進行了手術，並得到了手術經驗豐富的住院醫生的協助。根據荷蘭指南和腹腔鏡膽囊切除術的最佳實踐應用臨床安全技術[15,16]，在每隻豬中進行腹腔鏡膽囊切除術。使用6mg劑量（1mg / mL）對每隻動物測試一種染料。這是早期研究證明的足夠劑量的兩倍[10]。選擇劑量以獲得最大可視化，因為作者的假設是較高劑量的染料將導致更好的膽道成像。在染料注射後立即開始熒光成像，隨後在熒光模式和白光模式下間歇地進行成像。在手術中，研究人員在任何一種成像模式中系統地記錄了是否可以識別膽囊管或膽囊動脈的形式。為了就上述結構的識別達成協議，諮詢了主治醫生。如果經驗豐富的外科醫生非常確定地確定了其定位，則將結構評分為「已識別」。
術後定量熒光分析
使用OSIRIX v7.0.1成像軟體（Pixmeo，Geneva，Switzerland）評估程序的視頻記錄的熒光照射程度。使用該軟體，可以確定目標 - 背景比（TBR）。TBR定義為目標（膽囊動脈或膽囊管）中三個目標點的平均熒光強度（任意單位FI，AU），減去背景中三個目標點的平均熒光強度（肝門） ，除以背景中三個感興趣點的平均熒光強度。在公式中：TBR =（目標的FI - 背景的FI）/（FI背景）[8,10]。在這些感興趣的點上避免了具有光散射的區域。
結果
在所有實驗中，成功進行了用NIRF成像鑒定膽囊管和膽囊動脈。手術中獲得的結果見表1中的術中登記表。
表格1
術中登記表
在第一頭豬（IRDye800BK）中，注射熒光染料後直接清晰顯示膽囊動脈。15分鐘後，膽囊管顯示出NIRF信號。第二隻豬（IRDye800NOS）在注射染料後立即顯示出膽囊動脈。然而，由於該過程早期的技術問題，未記錄該可視化，因此不能從該熒光膽囊動脈獲得TBR。34分鐘後，膽囊管清晰可見。然而，膽囊的操作被證明對膽囊管的可視化有影響。脆弱管道的拉伸太多會阻止熒光染料的流入。這在34分鐘後得到糾正。與前兩頭豬一樣，在接受IRDye800CW染料的第三頭豬中也清晰可見膽囊動脈。30分鐘後，可以以熒光模式鑒定膽囊管。
在所有三隻豬中，除了膽囊管和膽囊動脈外，其他結構變得可見。雙眼子宮主觀上是所有三頭豬腹部中發熒光最多的子宮。此外，在所有三隻豬的熒光模式中都可以看到輸尿管，小腸和淋巴結。
目標與背景比率
術後，通過測量目標 - 背景比（TBR）來分析視頻記錄。IRDye800BK和IRDye800CW的膽囊動脈TBR分別為6.78和7.54。由於操作早期的視頻記錄程序存在技術問題，因此無法測量IRDye800NOS的膽囊動脈TBR。對於IRDye800BK，IRDye800NOS和IRDye800CW，來自三種染料的膽囊管的最大測量TBR分別為2.45（45分鐘），4.20（35分鐘）和2.15（45分鐘）。圖1-3顯示了在這些最大測量TBR期間的囊性導管。所有圖像均在Image1 SPIES系統的相同熒光設置下製作。然而，從圖像中可以看出，使用IRDye800NOS，腹腔鏡離膽囊管更遠。每種染料具有最大TBR的圖像顯示在圖1，圖22和圖33中。
圖1
在注射6mgIRDye800BK（1 mg / mL）後，觀察膽囊管45分鐘（最大信號的時間點）。注意，小白點是由散射引起的，並不代表熒光信號
圖2
注射6mgIRDye800NOS（1 mg / mL）後膽囊管（箭頭所示）和膽囊底部35 min（最大信號時間點）的可視化
圖3
在注射6mg的IRDye800CW（1mg / mL）後，可視化膽囊管（箭頭所示）和膽總管，45分鐘（最大信號的時間點）。注意白點是由散射引起的，並不代表熒光信號
安全
在手術過程中，沒有一隻豬出現併發症或不良反應，這可歸因於其中一種染料。特別是，沒有觀察到心率和呼吸狀態的血壓的改變。在注射熒光染料後的第一分鐘內，僅觀察到外周氧飽和度（SpO2）的術中監測的輕微和短暫的減少。
討論
在本研究中，研究了使用兩種新的臨床前染料用於肝外膽管的NIRF成像和市售的腹腔鏡成像系統。這種新染料類似於先前有利的IRDye800CW的結構和光譜特性，但成本低得多，現在屬於市售的ICG。這兩個特徵對於未來可能的臨床應用至關重要該實驗的目的是首先評估新染料的NIRF特性，並將其與IRDye800CW的性能進行比較。最終，這些染料可以替代ICG，ICG是目前唯一可用於膽道系統NIRF成像的染料。這與ICG一樣是理想的，儘管可以實現膽管的NIRF可視化，但目標 - 背景的觀察對比度仍有改進的空間。其他優點是染料注入和目標結構可視化之間的時間較短，以及這些新染料不含碘的事實，而一些商業上可獲得的ICG製劑[17]。因此，這些新染料也適用於已知具有碘過敏或過敏的患者。最終的好處是，這些染料不僅可以通過肝臟清除，還可以通過腎臟清除，這一點從IRDye800CW中已知。這可以使這些染料適合於輸尿管成像。
所有三種染料在靜脈注射後直接顯示出膽囊動脈的清晰可見性。在15至35分鐘之間，使用所有三種染料，實現了膽囊管的清晰可視化。IRDye800BK和IRDye800NOS均比早期測試的IRDye800CW產生更突出的熒光信號。在本研究中發現IRDye800CW的TBR為2.15，與TBR為2.3的早期研究相當[10]。來自IRDye800NOS的信號強於IRDye800BK的信號。這是預期的，因為IRDye800NOS的親水性較低，並且應該比IRDye800BK更通過膽汁排泄。在之前的一項研究中，ICG和IRDyeCW800的TBR具有可比性[10]。目前的結果表明IRDye800NOS可能對膽管成像更有效。這對應於外科醫生的主觀印象。當然，這些數據必須謹慎解釋並需要確認。本研究中TBR測量的一個可能的限制是腹腔鏡和膽囊管在不同時間點之間的距離不均勻。如圖1-3所示，使用IRDye800NOS的豬的距離更大。感興趣區域與腹腔鏡之間的較大距離可能導致較低的熒光強度[18]。然而，IRDye800NOS的TBR是所有發現的TBR中最高的。
由於染料的給葯，沒有不良反應。測量了氧飽和度的非常早期和短暫的降低;這是使用靜脈內熒光染料的常見現象[19-21]。血液顏色的瞬時變化導致氧氣測量結果錯誤地低於實際值。
在實驗過程中，觀察到三種染料都被肝臟（和排泄到膽汁中）和腎臟（並排泄到尿液中）清除。因此，所有三種染料都可能適用於膽道解剖結構和輸尿管的成像，但如前所述，IRDye800NOS更多地排泄在膽汁中，而尿液中的IRDye800BK更多。在該實驗中，通過IRDye800NOS的膽管中較高的TBR證實了這一點。這些染料的確切行為需要進一步研究膽道和尿液成像。由於尿液中染料量的不確定性，給定劑量設定為先前使用IRDye800CW成功進行膽管成像的實驗的兩倍[10]。本研究中IRDye800CW的TBR與之前的觀察結果相當，可能表明使用IRDye800CW時雙劑量無影響。在本研究中，與Schols等人的研究報告相比，IRDye800CW需要更長時間才能看到。2014年，膽囊管在11分鐘後可區分[10]。Tanaka等人。2014年大約20分鐘後在膽囊管中測量熒光，這與目前的結果相當[11]。使用的不同劑量可能對熒光出現之前的時間產生影響。也不能排除另一劑量而不是所選劑量給出優異的成像。需要進一步的實驗來確定受染料的葯代動力學性質影響的最佳劑量和時間。
該研究還有兩個局限。首先，由於實驗系列有限，必須謹慎解釋結果。由於僅使用了三頭豬，每種染料僅在一頭豬中進行測試。這導致在第二隻豬的早期開始錄像的失敗，其中IRDye800NOS被測試，在隨後的實驗中無法糾正。因此，在該豬中不可能用TBR測量膽囊動脈的可視化。另一個限制是作者觀察到膽囊和膽囊管的操作對膽汁中的熒光染料通過第二頭豬的膽囊管的流動的影響。不能排除通過適應操作可以獲得早期成像。這可能影響了其他豬的膽汁流量和詳細的時間測量。該程序的缺點是必須在膽道系統的NIRF和白光成像之間間歇地切換。這是所用設備所固有的。雖然同時白光和熒光成像可能更實用，但外科醫生並未將此視為阻礙，並且可以在足夠數量的時間點執行測量以執行相關觀察。
本研究主要關注新染料的評估，以優化NIRF成像。改善NIRF成像的另一種方法是改進設備及其性能。這種方法也很重要，但超出了本實驗的範圍。
結論
本研究顯示了兩種新的且價格合理的NIRF成像染料的有希望的結果：IRDye800BK和IRDye800NOS，用於膽囊管和膽囊動脈的近紅外熒光成像。目前，這些染料尚未獲得FDA批准，IRDye800CW的情況仍然如此，因此尚不適用於人體臨床實踐。新型染料似乎是IRDye800CW在豬膽囊管和膽囊動脈可視化中的良好替代品。為了成為目前唯一可供人類使用的染料的替代品，ICG需要進一步研究和FDA批准。
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