它是最容易造假的實驗之一，為啥學界用了40年還不放棄？
圖片來源：ptglab.com
編譯 李光昭 魏瀟
編輯 魏瀟
「科研圈」報道·keyanquan·
蛋白質印跡法（Western blotting，WB）可能是分子生物學和蛋白質組學研究中應用最廣泛的技術之一。如果你身邊有相關專業的小夥伴，他們很可能曾向你痛訴過自己的 WB 實驗血淚史。這項常被簡稱為「Western」或「蛋白電泳」的技術誕生於上世紀 70 年代，一直被用來分離動植物組織樣品中的特定蛋白，並能夠檢測相應蛋白的表達水平、相對活性和化學修飾等情況。
今年，Western blotting 迎來了它的 40 歲生日，雖然它仍然坐在蛋白質研究技術的「頭把交椅」上，但身後卻從來沒有缺少過批評與質疑。
從「西方」誕生
和許多研究技術的誕生類似，WB 也有不止一位「家長」。目前大家公認 1979 年 7 月 1 斯坦福大學 George Stark 實驗室發表於《美國國家科學院院刊》（PNAS）的論文是它的首次亮相。當時，這個初始版本的蛋白質印跡法還未進化為現在的常用版本：瓊脂凝膠或聚丙烯醯胺膠（PAGE）被作為電泳載體將樣品中不同大小的蛋白質分離開；隨後，效率不那麼高的毛細管虹吸印跡法被用來將蛋白轉印到重氮苄基羥甲基（diazobenzyloxymethyl）濾紙上；最後同位素 125-I 標記的蛋白 A 作為檢測抗體，來識別目標蛋白。
或許同一領域中，開拓者的想法總會出現巧合。兩個月後，來自瑞士弗雷德里克·米歇爾研究所（Friedrich Miescher Institute）的 Harry Towbin 和同事們也在PNAS上發表了蛋白質印跡技術的論文。不同的是，Towbin 在用於分離蛋白質的 PAGE 凝膠中加入了十二烷基硫酸鈉（SDS,一種強還原性的表面活性劑）或尿素，創造了SDS-PAGE 和 Urea-PAGE；在轉印中採用硝酸纖維素膜（NC 膜）為固定相，並且創立了轉印後先使用第一抗體識別蛋白、再使用第二抗體進行信號檢測的新系統。Towbin 實驗室的這篇論文雖然不是蛋白印跡法的首次亮相，但是其中的許多方法一直沿用至今，與目前實驗室中的 Western blotting 基本一致——很多實驗室的轉膜緩衝液（Towbin buffer）配方甚至都和 40 年前的一模一樣。
故事到這裡還沒有結束，來自弗雷德·哈欽森癌症研究中心（Fred Hutchinson Cancer Research Center）的 W. Neal Burnette 幾乎與前兩個實驗室同時完成了這項技術的論文手稿，但是他的發表之路卻沒那麼順利——《分析生物化學》（Analytical Biochemistry）一開始拒掉了他的投稿，直到兩年後的春天才回心轉意發表了這篇論文。由於 Burnette 的實驗室和發明者之一的 Stark 實驗室都位於美國西海岸，因此 Burnette 團隊沿用了 DNA 雜交印跡法（Southern blotting）和 RNA 雜交印跡法（Northern blotting）的命名傳統，在論文的標題中將這項技術稱為 Western blotting。至此，這項分子生物學實驗的「標配」才走完了它的誕生之路。
三個團隊中，Towbin 的技術方法最受歡迎——時至今日也依然是 WB 實驗的主流。因此儘管 Stark 實驗室的論文在發表時間上拔得頭籌，但 Towbin 的論文卻是三篇文章中引用數最高的，目前已經達到了五萬八千多次。
蛋白質印跡法流程圖。圖片來源：Western blotting: A guide to current methods
榮光與醜聞
在面世的前 15 年，WB 發展成了一項重要的檢測手段。1986 年，《新英格蘭醫學雜誌》（New England Journal of Medicine，NEJM）的一篇論文使用該技術在人類大腦組織中檢測到了克雅氏病（Creutzfeldt-Jakob）的標記蛋白，為疾病診斷提供了有力的方法。從免疫組學到神經科學再到新葯開發，WB 在科學領域應用廣泛，並做出了眾多貢獻。根據法國生物學家 Christian P. Moritz 的統計，PubMed 資料庫 1989 年發表的蛋白質研究中，光是將 WB 放在標題中的論文就有 156 篇，作為當時新興技術的 WB 如同現在的基因編輯技術，成為了學界的寵兒。
然而，這種風光並未能延續至今。二十世紀 90 年代以來，WB 對蛋白質半定量分析的準確性和可重複性開始遭受學界質疑，更糟糕的是它不斷被捲入學術造假的醜聞和風波中。伴隨它出現的幾乎總是「學術不端」和「職業終結」之類的壞消息。
在著名的學術打假平台「撤稿觀察」（Retraction Watch） 網站上，光是用「Western blot」 這個關鍵詞就能搜出 200 多篇文章和報道（不排除對同一件事的重複報道）。全職數據偵探、曹雪濤問題論文曝光者 Elisabeth Bik 曾和她的團隊掃描了 1995 - 2014 年間發表的 2 萬多篇涉及 WB 的學術論文，發現近 4%（782 篇）的論文都存在至少一張數據圖的不恰當複製和使用。雖然調查沒有明確這些問題數據是否都是 WB 圖片，但 Bik 認為其中大約有一半都是。
由於 WB 操作繁瑣、環節眾多，因此實驗者無意中犯錯的概率也隨之增加，這極大地影響了其準確性和重複性。而一些關鍵步驟，如樣本準備方式、免疫反應中一抗和二抗的抗體質量和濃度、條帶定量的分析方法，都對最終結果有著至關重要的影響。所以做出漂亮的 WB 結果並不那麼容易。
每個做 WB 的人的噩夢——白板。圖片來源：丁香園論壇上的網友
最常見的場景是，每個實驗室都有一套「專屬秘方」。當研究生們在一起討論封閉濃度和時間，轉膜時間和具體的電泳電壓參數的時候，彷彿大家做得都不是同一個「Western」。很多經驗豐富的實驗室老手都會感嘆 WB 是技術，更是一門藝術——對於提倡數據準確性和結論可重複性的現代西方科學來說，我們很難判斷這究竟是誇獎還是諷刺。
寶刀未老 or 中年危機
儘管學術界對 WB 有各種負面的評價，卻無法否認，WB 是一項檢測特定蛋白質的有效方法。種種數據表明，WB 技術雖然穩定發揮，但已經不在聚光燈下。
2018 年，PubMed 中共有 194,262 篇蛋白相關的論文，其中有16,196（8.3%）篇用到了 WB。時間跨度更廣的統計結果也顯示，儘管面臨種種非議，WB 的使用比例在過去 30 年中穩定在 8% 到 9% 左右。而且這一比例很有可能被低估：不少論文應用了該技術，卻沒有文字性地寫明，這類可能未能被統計入內。而更為現代和準確的蛋白質譜技術（MS），在過去十年中應用比例則穩定在 4%，僅僅是 WB 的一半。同時，相比於其他定量或半定量的蛋白質分析技術，如佔比 3% 的 ELISA（酶聯免疫吸附法），4% - 6% 的 IHC（免疫組化）和 4% - 5.5% 的顯微成像技術，WB依舊沒有丟掉應用率最高的寶座。
這或許得益於它的經濟性和簡易性。不過上世紀 80 年代曾被數百篇論文放在標題上的輝煌確實已經一去不回：1989 年是 WB 的頂峰，蛋白相關的論文題目中的提及比例達 34‰，而在近十年只有不到 0.5‰。相對的，質譜技術在近十年穩定在 5‰-6‰，遠高於其他蛋白檢測手段 0.5–2‰ 的數字。
圖為 Western blotting 在文章中和題目中的出現率，與其他檢測手段對比數據。圖片來源：40 years Western blotting: A scientific birthday toast
可期的未來
顯然，40 歲的 WB 並沒有過時——畢竟它的應用度在近十年中比其他蛋白鑒定與定量技術高出一倍之多。雖然 WB 的原理依舊，但這項技術已經有了多處改善，實現了更高效，更節省樣本量和更好的重複性。
WB 在高端學術雜誌的表現可能預示了它的發展方向。目前研究者們已經就 WB 的效率和小型化趨勢有所行動，比如以毛細管電泳或等電聚焦電泳代替傳統 PAGE 膠。值得一提的是，在改善後的方法中，更接近了「印跡法」的實際意義——蛋白質可以不被轉移，直接固定在毛細管中。此外，研究者們還在嘗試改良用某個特定蛋白做內部參照物的傳統定量方法，開始向總蛋白染色的方式轉變，希望以此加強該技術在免疫診斷領域的應用發展。
各種儀器設備的開發和提高也大幅度改善了 WB 的效率和準確性。總的來說，WB 的未來不僅取決於其技術流程上的改進，更要依靠於研究人員的專業性、科學家們（的態度），以及抗體公司的質量。
對於一名學者來說，在學術界工作 40 年可能意味一份即將到手的 「終生榮譽」，或者帶著曾經的非議走默默走向職業生涯的尾聲。而令人又愛又恨的 Western blotting ，仍將會帶著榮譽和非議繼續活躍在所有需要它的實驗室里。
參考資料：
1.Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques.
2.Western blotting: A guide to current methods.
3.40 years Western blotting: A scientific birthday toast.
