四君子湯對脾虛模型小鼠消化功能的影響——萬融實驗
【實驗目的】本實驗通過苦寒瀉下法製作脾虛小鼠模型，讓學生熟悉中醫脾虛證動物模型的造模方法，並從生理學、病理學、生物化學等方面揭示脾虛的本質，以補脾益氣典型方劑進行反證，培養學生多學科的實驗技術和進行中醫科研的思維和方法。
【實驗原理】大黃瀉下致脾虛動物模型的消化系統功能具有不同程度的損害，因此，選用與消化功能相關的指標，如血清D-木糖排泄率、澱粉酶活性、琥珀酸脫氫酶以及酚紅在消化道的排泄等指標反映消化系統功能，並以四君子湯這一健脾益氣的典型方劑干預，驗證補脾方劑的效果。
【實驗對象】昆明種小鼠，清潔級，體重18g±2g。
【實驗材料】器材：灌胃針，彎鉗，彎鑷，眼科剪，彎剪，小鼠固定板。試劑：100%大黃製劑，D-木糖醇，酚紅糊劑，澱粉酶試劑盒，琥珀酸脫氫酶試劑盒，四君子湯。
【方劑解讀】四君子湯方解參見第二章實驗五「氣能生血理論的實驗觀察」。
【實驗步驟】
1. 試劑的配製（1）100%大黃製劑的製備：大黃用水浸泡1小時後，煮沸40分鐘，用紗布過濾，再加入冷水煮沸20分鐘，過濾後合併兩次濾液，於60℃水浴濃縮成100%（1g生葯/mL）煎液，4℃保存。（2）酚紅糊劑：按每15mL 0.02%酚紅溶液加1g澱粉的比例加熱調成糊劑即可。
2.分組小鼠隨機稱重、標號，分為正常對照組、脾虛模型組和四君子湯治療組，每組10隻。
3.小鼠脾虛模型的製備小鼠每日餵食大黃水浸煎劑1mL（相當於生葯1g），連續餵養8天，並每天觀察它的表現，脾虛動物會出現體重減輕、倦怠、便溏、毛髮枯槁、畏寒等癥狀。第9天灌服四君子湯反證治療8天，觀察小鼠體重的變化和其他癥狀的改善。
4.取材取血測定血清中澱粉酶和琥珀酸脫氫酶的活性；取尿液測定D-木糖含量；取消化系統各段測定酚紅的含量。
5.指標的測定
（1）D-木糖排泄率測定：參照文獻方法，測定小鼠尿中D-木糖含量。
（2）血清澱粉酶和琥珀酸脫氫酶活性測定：採用比色法測定。
（3）胃排空、腸推進速度測定：各組動物按照25mL/kg體重灌服酚紅糊劑，30分鐘後脫臼處死動物，結紮賁門、幽門及回盲部，從幽門至回盲部6等分剪斷小腸，依次為第1段、第2段至第6段，分別將胃和各段小腸取出剪碎，用蒸餾水沖洗3次，至洗液體積為3mL。而後在各管中分別加入0.3mo1/L Ba（OH）21mL，充分混勻後靜置3～5分鐘，再各加1mL 15% ZnSO4，混勻後3000r/min離心10分鐘，各取上清液3mL加10% NaOH 0.5mL，混勻後測光密度，對照標準曲線算出胃和小腸各段酚紅殘留率。胃排空百分率、小腸推進相對百分率（指小腸各段酚紅的殘留量占整個小腸酚紅總量的百分比）按下列公式計算：胃排空百分率（%）=〔灌入胃中酚紅總量（mg）-胃中殘留量（mg）〕/〔胃中酚紅總量（mg）〕×100%小腸推進相對百分率（%）=〔小腸某段酚紅殘留量（mg）/小腸各段酚紅殘留量之和（mg）〕×100%實驗數據記錄見表7-1。
6. 統計學處理使用SPSS10.0統計軟體，採用單因素方差分析比較各組之間的差異。
【注意事項】
1.脾虛癥狀的出現是一個漸進的過程，因此，注意觀察動物的表現。
2.摘眼球取血時注意不要溶血。
【結果與分析】
1.一般體征變化在造模後各組小鼠逐漸出現委靡倦怠、眯眼、少動、便溏、泄瀉、耳色淡白、耳朵後背被毛散亂無光澤等脾虛證的表現，勞倦過度組小鼠較其他造模組小鼠更加懶動，受刺激反應更加遲鈍，行走呈匍匐狀。
2.消化系統功能（1）血清D-木糖含量：是與小腸吸收功能成正相關的一個較為敏感和特異的檢測指標。本次實驗結果表明，模型組小鼠血清中D-木糖含量與對照組相比顯著降低，表明脾虛小鼠D-木糖醇吸收率減低，四君子湯治療後，D-木糖醇吸收率減低現象得到明顯改善。（2）澱粉酶活性：也是一個反映消化吸收功能較為敏感和特異的檢測指標。脾虛模型動物血清澱粉酶活性顯著降低，四君子湯對澱粉酶的活性具有一定的改善作用。（3）琥珀酸脫氫酶：是細胞線粒體內膜氧化磷酸化的標誌酶之一，琥珀酸脫氫酶活性下降時，細胞物質轉運、能量代謝功能低下，影響離子運送，從而使細胞內池腔混濁腫脹，影響消化酶合成與分泌，以及細胞正常生理功能活動，以致消化吸收障礙。本實驗結果表明，模型組小鼠血清中琥珀酸脫氫酶活性與對照組相比均顯著降低，而四君子湯能夠改善琥珀酸脫氫酶的活性。（4）胃排空、腸道推進速度：是胃腸平滑肌在神經、體液因素調節下電活動、機械活動協調的結果，採用測定小腸各段酚紅含量的變化，能更客觀、準確地反映食物在小腸的推進狀況。模型組小鼠小腸各段酚紅的含量均降低。
【探索問題】
1.脾虛證形成的病因病機是什麼？
2.大黃導致脾虛的機制是什麼？與臨床人的脾虛證的成因有什麼不同？該模型有何可改進之處？
3. 四君子湯改善脾虛癥狀的機制是什麼？
4.中醫脾虛證的病變本質是什麼？
