釀酒酵母中可能替代糖發酵的天然甲醇同化途徑的自適應實驗室進化
編譯：林芷薇，張子明，魏韜（華南農業大學食品學院）
研究表明，釀酒酵母等真核模式生物代謝甲醇的能力一直很差，這使得利用甲醇代謝途徑替代糖發酵應用於發酵工程一直受限。2020年11月04日，Monica I. Espinosa等人在《Nature Communications》上發表了題為《Adaptive laboratory evolution of native methanol assimilation in Saccharomyces cerevisiae》的文章，表明在實驗室菌株CEN.PK中發現了甲醇特異性轉錄組反應以及甲醇特異性生長，並使用自適應實驗室進化（ALE）表徵了CEN.PK中的甲醇代謝途徑，這項研究為進一步生物技術發展和釀酒酵母等真核模式生物的工業應用提供了基礎。
現如今，利用二氧化碳、甲烷和甲醇等單碳基質對解決當前的氣候危機至關重要。在生物經濟中微生物代謝應用於將可再生材料轉化為有用產品，微生物代謝通常以甘蔗或玉米中提取的糖作原料，但製糖費用高昂。而像甲基營養型生物的甲醇營養代謝為糖發酵提供了替代品。將易從天然氣或農業、城市或工業廢物等廢物資源中獲得的甲醇等C1化合物替代糖為原料，應用於生產食品、燃料和化學品的發酵工程，已成為合成生物學領域的主要目標。例如，甲醇營養型酵母中巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris，現更名為Komagataella phaffii9）目前在工業上用於生產重組蛋白、還用於從糖中生產包括蝦青素和異丁醇在內的代謝產物。
然而與模式生物相比，大多數天然甲基營養型微生物的利用甲醇的能力有限、無法達到高產，所以近期也有研究側重於將大腸桿菌和谷氨酸皮質桿菌等細菌人工培養成甲基營養型。同樣地，釀酒酵母等模式真核生物代謝甲醇的能力一直很差，而釀酒酵母在工業發酵中具有明顯的優勢，例如，釀酒酵母菌可以正確表達、摺疊和翻譯後修飾真核蛋白，不易受到噬菌體污染，對低pH濃度和甲醇等溶劑具有高耐受性，並具有細胞器，可以用於專業代謝的定位。
Monica I. Espinosa的團隊在實驗室菌株CEN.PK中發現了甲醇特異性轉錄組反應以及甲醇特異性生長，甚至強過於實驗室菌株S288C。他們使用自適應實驗室進化（ALE）表徵CEN.PK中的甲醇代謝途徑，確定了釀酒酵母將甲醇同化到中央碳代謝中的天然能力；並利用甲醇特異性生長分析法和13C-甲醇示蹤研究，我們表徵並改善了釀酒酵母菌的天然甲醇同化。
實驗者比較了兩種常用的釀酒酵母菌株S288C和CEN.PK 113-5D在甲醇存在下的轉錄反應和生長情況，認為CEN.PK是培養成甲基營養型的理想菌種。進一步用含和不含2％甲醇和0.1％酵母提取物的液態酵母氮鹼（YNB）培養基來評估甲醇對生長的影響，證實了在含有酵母提取物的液體培養基中甲醇特異性的增長。為了更深地研究釀酒酵母中的甲醇反應並確定在共底物酵母提取物存在下甲醇進入中心碳代謝的程度，進行了13 C-甲醇示蹤劑分析，結果證明釀酒酵母具有天然的甲醇同化能力。
ALE用於表徵和改善釀酒酵母中的天然甲醇代謝，依靠自然發生的DNA複製錯誤在種群中產生遺傳多樣性。實驗者在兩種不同的培養基之間進行脈衝處理，同時將群體與不良的共底物（酵母提取物）一起暴露於甲醇中作為選擇壓力，培養了總共六個獨立的世系，生長了230代，對六個進化的種群進行重新測序，以鑒定導致表型的推定突變。實驗證明了翻譯過程過早終止，導致YGR067C蛋白的截短，這段截短的轉錄因子在甲醇存在下負責不斷生長。
實驗者重建EC菌株，該菌株與CEN.PK 113-5D之間唯一基因型變化是YGR067C的引入截斷，通過13 C-甲醇示蹤劑分析、轉錄組學和蛋白質組學分析重建進化菌株在代謝物、轉錄組和蛋白質組的水平表徵均表明，重組菌株與親本菌株的中心碳代謝途徑表達發生了顯著變化。與CEN.PK 113-5D相比，重建的EC菌株中涉及糖酵解的5個基因?(HXK1、GLK1、DAK2、TDH1和ENO2)轉錄丰度更高,而參與糖生成的關鍵酶果糖-1,6-二磷酸酶的FBP1轉錄本丰度較低，6-磷酸果糖-2-激酶糖酵解調節因子PFK2731轉錄丰度也相對增加。Hxk1p、Glk1p、Tdh1p、Eno2pye和Pfk1p蛋白丰度也增加了，均說明重建EC菌株在甲醇的生長過程中主要發生糖酵解而不是糖異生作用。另外參與TCA循環的9個基因(CIT1、CIT2、ACO1、IDH1、IDH2、KGD2、SDH1、SDH3和FUM3)轉錄丰度較低，表明在甲醇和酵母提取物的作用下，TCA循環被下調。參與天然甲醛解毒和酒精氧化的Sfa1p增加了重建EC菌株的蛋白質丰度。有趣的是，戊糖磷酸途徑顯示RKI1轉錄丰度較低，Tkl2p蛋白丰度較低，而Tal1p和Fba1p蛋白丰度較高。
研究者們又選擇了ADH2、CAT8、SHM1、ACS1四個基因來分析它們在重建的EC菌株中天然甲醇代謝中的潛在作用，具體方法是在重構的EC菌株中構建上述基因的單缺失菌株，並通過將菌株點樣到具有2％葡萄糖，無額外碳源或增加甲醇濃度的固體基本YNB培養基上進行測試，結果表明ADH2和ACS1的缺失將減少甲醇特異性生長，因為ADH2對甲醇有明顯的上調作用，它能將甲醇氧化為甲醛；ACS1在巴斯德畢赤酵母中參與了乙醇的抑制，這是表達甲醇誘導的基因所必需的。
雖然之前釀酒酵母從未被歸類為甲基營養型菌，並且在文獻中沒有記錄過甲醇的早期生長或同化，但從13C-甲醇中完全13C標記的代謝產物的鑒定清楚地表明，甲醇可以通過釀酒酵母中的中心碳代謝同化。Ygr067cp的截短可能導致通常被抑制的基因的持續穩定表達，從而導致更有利的調節條件和甲醇生長所需的代謝通量。綜合代謝組學、轉錄組學和蛋白質組學的分析表明，相對於親本對照菌株，在重建EC菌株中甲醇同化過程中可能發生凈糖酵解通量增加。
研究者們在釀酒酵母中發現了天然甲醇的同化作用，並通過ALE進行了改進，從而提供了探索天然甲醇代謝的可能性。這項工作的結果代表了在微生物發酵過程中使用可持續原料轉化為化學品、燃料、材料、藥品和食品的激動人心的一步，並提供了真核生物模型中未探索的代謝網路的概覽。
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